1、聚丙烯酰胺凝膠分離白蛋白聚丙烯酰胺凝膠分離白蛋白實驗目的實驗目的l (1) 學習聚丙烯酰胺凝膠電泳原理。l (2) 掌握聚丙烯酰胺凝膠垂直板電泳的操作技術。實驗原理實驗原理l聚丙烯酰胺凝膠電泳是以聚丙烯酰胺凝膠為載體的一種區帶電泳。該凝膠由丙烯酰胺（Acr）和交聯劑N，N甲叉雙丙烯聚酰胺（Bis）聚合而成。利用電泳和分子篩的雙重作用分離物質。l Acr和Bis單獨存在或混合在一起時是穩定的，但在具有自由基團體系時就能聚合。引發自由基團的方法有化學法和光化學法兩種。化學法的引發劑是過硫酸胺（Ap），催化劑是四甲基乙二胺（TEMED）；光化學法是以光敏感物核黃素來代替過硫酸胺，在紫外光照射下引發自

2、由基團。實驗原理實驗原理l采用不同濃度的Acr、Bis 、Ap、TEMED使之聚合，產生不同孔徑的凝膠。因此可按分離物質的大小，形狀來選擇凝膠濃度。l在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質的遷移率取決于它所帶的凈電荷的多少、分子的大小和形狀。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸（縮寫SDS）加熱處理蛋白質樣品，蛋白質分子中的二硫鍵將被還原，并且1g蛋白質可定量結合1.4g SDS，亞基的構象呈長橢圓棒狀。由于與蛋白質結合的SDS呈解離狀態，使蛋白質亞基帶上大量負電荷，其數值大大超過蛋白質原有的電荷密度，掩蓋了不同亞基間原有的電荷差異。各種蛋白質-SDS復合物具有相同的電荷密度，電泳時

3、純粹靠凝膠的分子篩效應進行分離。實驗材料與試劑實驗材料與試劑1、材料 標準樣和BSA（小牛血清白蛋白）2、試劑 1）30%丙烯酰胺(Acr)/0.8%N,N-甲叉雙丙烯酰胺（BIS） 2）5SDS/電泳緩沖液,稀釋成1 3）Tris-HCl/SDS,pH 6.8 4）Tris-HCl/SDS,pH 8.8 5）10%過硫酸銨(AP) 6）TEMED 商品試劑實驗步驟實驗步驟l裝配制膠用的玻璃板l制分離膠：按所需的濃度配制12.5分離膠分離膠。30%Acr-BisTris-HClPh8.8H2O10%APTEMED5ml3ml4ml120l20l 灌完分離膠后在膠面上小心加水封（注意不要沖壞膠面

4、），等膠自然凝聚后（這時候在膠面與水封之間可以看見清晰的界限）l3、制濃縮膠濃縮膠：按所需的濃度配制4%的濃縮膠濃縮膠，配方如下：30%Arc-Bis Tris-HCl pH 6.8 H2O10%APTEMED400 l750 l1800 l50 l7.5 l l5加樣：取大腸桿菌和BSA蛋白樣品加樣，每個加樣孔加樣不宜過多，一般每孔加樣7.5L。l6電泳：先恒壓80V，待樣品進入分離膠后，調電壓為120V（恒壓）。當溴酚藍移動到離底部約0.5cm時，停止電泳。l7翹開玻璃板，將濃縮膠切掉, 剝下凝膠，準備染 色。l8 凝膠染色：使用考馬斯亮藍R250染色。兩塊膠（小盒子）或四塊膠（大盒子）同步染色脫色。蓋上蓋子用微波爐加熱約15-20秒，搖床振蕩15分鐘，回收染液至指定容器。清水漂洗后加入脫色液（25%乙醇，7.5%乙酸）脫色，用量和步驟與染色相同，脫色兩次，每次10分鐘。注意事項注意事項l(1) Acr和Bis均為神經毒劑，對皮膚有刺激作用，操作時應戴手套和口罩。l (2) 玻璃板表面應光滑潔凈，否則在電泳時會造成凝膠板與玻璃板之間產生氣泡。l (3) 樣品槽模板梳齒應平整光滑。l (4) 灌凝膠時不能有氣泡，以免影響電泳時電流的通過。l (5) 切勿破壞加樣凹槽底部的平整，以免電