1、 實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)8 Folin-酚試劑法測定蛋酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量白質(zhì)含量Lowry根本法根本法v一一 目的與要求目的與要求vFolin-Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法。和方法。二二 實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理vFolin-酚試劑Folin-phenol reagent的顯色原理主要是：試劑中的磷鉬酸-磷鎢酸混合物被蛋白質(zhì)復(fù)原，構(gòu)成多種復(fù)原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)色。包括兩步反響。v 試劑甲使蛋白質(zhì)發(fā)生烯醇化反響，在堿性條件下，構(gòu)成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物，從而使電子轉(zhuǎn)移到混合酸中，大大地加強(qiáng)了酚試劑對蛋白質(zhì)的敏感性。v 試劑乙磷鉬酸-磷鎢酸混合液受蛋白質(zhì)中半胱氨酸、酪

2、氨酸、色氨酸和組氨酸等作用，使鎢酸、鉬酸兩者同時失去1個、2個或3個氧原子，復(fù)原成含有多種復(fù)原型的混合酸，并且有特殊的藍(lán)色。v利用藍(lán)色深淺與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，可制備規(guī)范曲線，測定樣品中蛋白質(zhì)含量。本法可測定的蛋白質(zhì)含量為15-280g/mL。三三 操作步驟操作步驟 規(guī)范曲線制造規(guī)范曲線制造v 取試管6支，編號。按表7-2操作，參與牛血潔白蛋白規(guī)范溶液200g/mL，補(bǔ)足蒸餾水，使各管容量達(dá)1mL。算出各管中實(shí)踐蛋白質(zhì)含量，然后按順序參與定量試劑甲、乙各管參與乙試劑必需快速，并立刻搖勻！，在分光光度計(jì)以上波長500nm比色，讀取光密度。表7-2 Folin-酚試劑法規(guī)范曲線制造步驟管號牛血清蛋白

3、標(biāo)準(zhǔn)溶液/mL蒸餾水/mL各管加試劑甲2.5mL，混勻放置10min后，加入試劑乙0.25mL，立即混勻，放置30min OD50010.20.820.40.630.60.440.80.251.00601.0v2. 以各規(guī)范溶液濃度為橫坐標(biāo)，各管的光密度為縱坐標(biāo)作圖，得規(guī)范曲線。v規(guī)范曲線必需從零點(diǎn)開場出發(fā)，最好能成不斷線。畫好后，注明所用儀器的型號及編號、所用波長及測定方法、稱號及制造日期。v 樣品測定v取試管3支，分為測定管和空白管和規(guī)范管。測定管內(nèi)參與1mL待測樣品溶液適當(dāng)稀釋至25-280g/mL蛋白質(zhì)。操作步驟與制造規(guī)范曲線一樣，見表7-3。待測液mL蒸餾水mL各管加試劑甲2.5mL，混勻放置10min后，加入試劑乙0.25mL，立即混勻，放置10min后比色。 OD500 空白管 01.0測定管1.00標(biāo)準(zhǔn)管1.0（標(biāo)準(zhǔn)液）0v四四 結(jié)果與計(jì)算結(jié)果與計(jì)算v根據(jù)光密度讀數(shù)查得規(guī)范曲線，根據(jù)光密度讀數(shù)查得規(guī)范曲線，計(jì)算檢測液內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。進(jìn)計(jì)算檢測液內(nèi)的蛋白質(zhì)含量。進(jìn)一步可根據(jù)檢測溶液的稀釋倍數(shù)一步可根據(jù)檢測溶液的稀釋倍數(shù)及實(shí)踐所要求的蛋白質(zhì)濃度換算。及實(shí)踐所要求的蛋白質(zhì)濃度換算。本實(shí)驗(yàn)要求蛋白質(zhì)含量濃度以本實(shí)驗(yàn)要求蛋白質(zhì)含量濃度以g/Lg/L為單位，也可以與測定管同為單位，也可以與測定管同樣操作的