1、1 第三節第三節 大腸桿菌分子克隆載體大腸桿菌分子克隆載體2一、一、E.coli克隆載體的種類克隆載體的種類 1. 質粒載體質粒載體復制起點來自一些天然質粒。復制起點來自一些天然質粒。 2. 噬菌體載體噬菌體載體，P1和和M13、fd載體，復制載體，復制起點來自噬菌體。起點來自噬菌體。 3. COS質粒載體質粒載體質粒載體中插入質粒載體中插入cos片段，片段，以利于體外包裝以利于體外包裝 4.4.噬粒載體（噬粒載體（phagemidphagemid）有質粒和有質粒和M13、fdfd的復制起點，以質?；蚴删w方式復制。的復制起點，以質粒或噬菌體方式復制。 3二、質粒與質粒載體二、質粒與質粒載體

2、1. Ecoli的質粒種類的質粒種類 1) colE1因子（大腸桿菌素因子）因子（大腸桿菌素因子）多數不能進行接多數不能進行接合轉移合轉移DNA，屬高拷貝松弛型。，屬高拷貝松弛型。 2) R因子（抗藥性因子）因子（抗藥性因子） 可接合轉移可接合轉移DNA，屬低拷貝，屬低拷貝 嚴緊型，嚴緊型， 質粒較大，操作不便質粒較大，操作不便 3) F因子（性因子）因子（性因子）42.質粒的特點質粒的特點 1) 質粒質粒DNA復制與染色體復制無關復制與染色體復制無關 2) 質粒質粒DNA以超螺旋形式存在以超螺旋形式存在 3) 質粒質粒DNA可以接合轉移可以接合轉移 4) 質粒的不相容性和不相容群質粒的不相容

3、性和不相容群 5) 質粒質粒DNA的消除的消除化學和物理法化學和物理法(吖啶染料，吖啶染料，EtBr，高溫等，高溫等) 6) 質粒的整合質粒的整合F因子又可整合到因子又可整合到E.coli染色體中染色體中 3.質粒質粒DNA的轉移的轉移 1）質粒質粒DNA的轉移過程的轉移過程 5donor cellRecipient cellnick-ligation at oriTdonor cell3)分離2)tro基因表達1)重新環化DNA轉移供體接合 DNA合成traT穩定化細胞壁接觸不穩定接合對性繖毛收縮繖毛結合性繖毛-細胞壁接觸+質粒的自主轉移過程質粒的自主轉移過程 65353質粒質粒DNA的轉移

4、和復制的轉移和復制 7 2）質粒轉移的必備條件質粒轉移的必備條件 .轉移起點轉移起點(oriT),它是質粒它是質粒DNA轉移時的復制起點轉移時的復制起點順順式式 作用（作用（cis-action） ii. 細胞附屬物細胞附屬物性纖毛，由蛋白質構成性纖毛，由蛋白質構成反式作用反式作用 .轉移過程所需的全部酶類轉移過程所需的全部酶類反式作用反式作用 3）質粒轉移類型質粒轉移類型 .自我轉移（自我轉移（Self-transmissible） .輔助轉移（輔助轉移（Donation）可轉移質粒僅具備可轉移質粒僅具備oriT，若，若無輔助質粒，前者不會發生接合轉移。若輔助質?？蔁o輔助質粒，前者不會發生接

5、合轉移。若輔助質粒可提供所有反式作用的蛋白質，前者便會發生接合轉移。提供所有反式作用的蛋白質，前者便會發生接合轉移。 .重組轉移（重組轉移（conduction）若質粒無若質粒無oriT，該質粒只，該質粒只有整合到輔助質粒有整合到輔助質粒DNA中，重組質粒便可轉移。中，重組質粒便可轉移。 因此，用于克隆外源因此，用于克隆外源DNADNA的分子克隆載體，只要具的分子克隆載體，只要具備備oriToriT即可，另外兩類功能基因可置于輔助質粒上，即可，另外兩類功能基因可置于輔助質粒上，該質粒一般沒有該質粒一般沒有oriToriT，因而可以減少后者進入另一種，因而可以減少后者進入另一種細胞的頻率。細胞的

6、頻率。 8+導入自主轉移H +H donor無DNA轉移H 輔助轉移H質粒自主轉移質粒自主轉移R+RRR R+Notransfer+H H 重組DNA 轉移質粒的輔助轉移質粒的輔助轉移質粒的重組轉移質粒的重組轉移 R-重組重組DNA分子分子 9 4.質粒質粒DNA的復制和調節控制的復制和調節控制 1) 復制機制復制機制復制方向、終止和方式復制方向、終止和方式 2) 質?？截悢档目刂瀑|?？截悢档目刂埔种苿┠Ｐ停焊呖截愘|粒需抑制劑模型：高拷貝質粒需高濃度抑制劑，低拷貝質粒需低濃度抑制劑，同高濃度抑制劑，低拷貝質粒需低濃度抑制劑，同一不相容群質粒產生的抑制劑可交叉相互作用。一不相容群質粒產生的抑制劑

7、可交叉相互作用。 3) 質粒的復制調控機制質粒的復制調控機制 例子例子: ColE1質粒的復制及復制起點結構質粒的復制及復制起點結構 Boros etal.(1984)分離到一個分離到一個pBR322突變體，突變體，其拷貝數可達其拷貝數可達1000/ cell或或65%總總DNA，原因是在，原因是在RNAI基因的基因的3端附近發生一次端附近發生一次GT顛換。顛換。10-555bpRNA II(primase)oriRNaseHColE1質粒質粒復制起點結構復制起點結構質粒質粒DNA的的復制過程復制過程 115.大腸桿菌質粒載體大腸桿菌質粒載體 1) 常用質粒載體的復制子常用質粒載體的復制子 質

8、粒載體質粒載體 復制子來源復制子來源 拷貝數拷貝數 pBR322系列系列 pMB1 15-20 pUC系列系列 pMB1 500-700 pACYC系列系列 p15A 10-12 pSC101系列系列 pSC101 25 colE1 colE1 15-20 2) 質粒載體常用的遺傳標記基因質粒載體常用的遺傳標記基因 Apr Cmr Kanr Neor Tcr Hygr LacZ LacZ 3) 多克隆位點區多克隆位點區 大多數從大多數從pUCpUC系列中的多克隆位點衍生出來的系列中的多克隆位點衍生出來的 12 6.實例實例pUC18和和pUC19 pUC系列質粒載體由系列質粒載體由Messin

9、g et al.構建，具有三個構建，具有三個顯著特點：顯著特點： 1）分子量小，僅為）分子量小，僅為2.7KB，容納外源，容納外源DNA量增大量增大 2）易于檢測是否有外源）易于檢測是否有外源DNA插入的標記基因插入的標記基因LacZ 3）多克隆位點區）多克隆位點區 .多克隆位點成對地存在于多克隆位點成對地存在于pUC18和和pUC19中，位點排列中，位點排列順序相同，但方向相反。順序相同，但方向相反。 這種排列方式有利于外源這種排列方式有利于外源DNA的克隆和定向插入的克隆和定向插入 .產生不同末端規律排列產生不同末端規律排列: 兩端限制酶位點產生兩端限制酶位點產生5突起突起端（端（EcoR

10、I和和Hind），與之相鄰的兩個限制酶位點產），與之相鄰的兩個限制酶位點產生生3突起端（突起端（SstI、KpnI、SphI、PstI），中央四個限），中央四個限制酶位點產生制酶位點產生5突起端或平端。這種排列方式十分有突起端或平端。這種排列方式十分有利于插入利于插入DNA片段的單向缺失和缺失片段的回收。片段的單向缺失和缺失片段的回收。13EcoSacKpnSmaBamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(

11、2.68kb)rpUC18和和pUC19載體載體14 如插入片段的如插入片段的5段定向缺失段定向缺失: XbaISphIExoS1T4 DNA lingase; 插入片段的插入片段的3-端亦可采用類似的方法進行缺端亦可采用類似的方法進行缺失（失（SmaISstIExoS1T4 DNA lingase） 不同載體中的多克隆位點區可以供不同目的片段的重組。又不同載體中的多克隆位點區可以供不同目的片段的重組。又例如例如: pBS+多克隆位點區的排列順序是多克隆位點區的排列順序是(見圖見圖)： 假設有一假設有一EcoRIHind DNA片段，并要求在其片段，并要求在其3-末端或末端或5-端接上另外的端

12、接上另外的DNA片段（如終止子、啟動子），片段（如終止子、啟動子），顯然，顯然，pUC系列載體的多克隆位點區是不太適宜，但選用系列載體的多克隆位點區是不太適宜，但選用pBS+中的多克隆位點區就能滿足要求。中的多克隆位點區就能滿足要求。 . 多克隆位點集中排列多克隆位點集中排列，有利于克隆片段的物理圖譜的有利于克隆片段的物理圖譜的繪制。繪制。 除上述三個特點外，除上述三個特點外，pUC系列載體還可用于表達外源系列載體還可用于表達外源基因基因 （LacZ啟動子）。啟動子）。15Plac Plac LacZorioriF1(-)Ampr T 3 T 7 pBS-SK(-)pBS-KS(-)pBS(3

13、.0 kb)pBS載體的結構載體的結構16 三三. 噬菌體載體噬菌體載體 1. 噬菌體噬菌體載體載體 1）的結構和特點的結構和特點 i. 一般結構：一般結構：48,502bp，線狀，線狀ds-DNA，兩端具有，兩端具有12n.t 5-突起（突起（5-GGGCGGCGACCT-3）該末端稱為）該末端稱為cos位點，可被位點，可被編碼的末端酶所識別（該酶由編碼的末端酶所識別（該酶由末端的兩末端的兩個基因個基因Nul和和A編碼蛋白編碼蛋白gpNul和和gpA組成）組成） ii. 基因結構基因結構46個基因，分為以下四類：個基因，分為以下四類： ) 調控基因：調控基因：C、N、CI、Cro、C決定進入

14、溶決定進入溶源化還是裂解狀態源化還是裂解狀態 ) DNA復制：復制：O、P、Q )重組：重組：int、xis、red和和gam )噬菌體顆粒形成與細胞裂解：頭噬菌體顆粒形成與細胞裂解：頭(A-F)、尾、尾(E-J)、S & R （細胞裂解）（細胞裂解）中部約中部約1/3的的DNA(b2)與與存活無關。存活無關。17w G T A B C D E Z U V H K I J N O P Q S R 免疫和調控整合切除、重組DNA合成宿主裂解att PIkiltLOLPLNPMtMOriPRtR1ORTR2cIintexocIII relOPQSRPRCrotLOLORtR1PLtR2NP

15、R后早期激活后期tMPMP ECI阻遏物溶源性建立和保持M L頭 尾Pi大腸桿菌大腸桿菌噬菌體的基因和表達調控噬菌體的基因和表達調控18 2) 噬菌體基因的表達噬菌體基因的表達 i. 最早期轉錄：轉錄起始于最早期轉錄：轉錄起始于CI基因兩側的基因兩側的PL和和PR啟動子，啟動子，止于止于N和和Cro末端的末端的tL和和tR1，有的右向轉錄物可継續通，有的右向轉錄物可継續通過過O和和P止于止于tR2。 ii. 后早期轉錄：后早期轉錄：N蛋白可使宿主細胞轉錄終止因子蛋白可使宿主細胞轉錄終止因子失活，失活，導致轉錄通過導致轉錄通過tR1、tR2和和tL進入其余早期基因區域。進入其余早期基因區域。 i

16、ii. 后期轉錄：后期轉錄：cro蛋白可與蛋白可與OL和和OR結合，阻止結合，阻止RNA聚合聚合酶與酶與PL和和PR結合，轉錄終止，此時已合成了足夠多的結合，轉錄終止，此時已合成了足夠多的控制蛋白控制蛋白Q，它對，它對PR起激活作用，導致后期基因轉錄。起激活作用，導致后期基因轉錄。 iv. DNA復制：因早期轉錄獲復制：因早期轉錄獲DNA復制蛋白復制蛋白O和和P，雙向，雙向復制開始。復制開始。 v. 包裝：包裝：Nul和和A蛋白與蛋白與DNA的的cos位點的識別與切割，位點的識別與切割，FI蛋白促進蛋白促進DNA進入頭部蛋白，進入頭部蛋白，DNA充滿后，充滿后，gpw和和gpF將頭部封住，然后

17、與尾部相連，形成噬菌體顆粒。將頭部封住，然后與尾部相連，形成噬菌體顆粒。19 vi. 裂解：基因裂解：基因R和和S產物形成，細菌細胞裂解，噬菌體顆產物形成，細菌細胞裂解，噬菌體顆粒釋放。粒釋放。 vii. 溶源反應：溶源反應：C和和C基因產物分別激活基因產物分別激活PE和和PI的左向的左向轉錄，致使轉錄，致使CI和和int基因表達，基因表達，CI 產物可阻止早期轉錄，產物可阻止早期轉錄，導致后期基因表達受阻。導致后期基因表達受阻。 對于裂解反應和溶源反應的選擇，取決于感染細胞中對于裂解反應和溶源反應的選擇，取決于感染細胞中一系列宿主和噬菌體因子間錯綜復雜的精細平衡關系。一系列宿主和噬菌體因子間

18、錯綜復雜的精細平衡關系。* 當當DNA注入宿主細胞后，線狀注入宿主細胞后，線狀DNA首先環化為環狀首先環化為環狀DNA，這種環化有以下幾點好處：，這種環化有以下幾點好處： a. 若為單向復制，不管從何處開始復制，全基因組均若為單向復制，不管從何處開始復制，全基因組均 可全部復制可全部復制 b. 噬菌體噬菌體DNA插入宿主染色體插入宿主染色體DNA，只需一次位點，只需一次位點特異性重組特異性重組 c. 拓撲異構酶易于對其進行不足和過度加旋拓撲異構酶易于對其進行不足和過度加旋 d. 受損的基因組增大了存活的可能性，因為雙向復受損的基因組增大了存活的可能性，因為雙向復制不會受阻于制不會受阻于 損傷的

19、損傷的DNA鏈，而單向復制就不能通過鏈，而單向復制就不能通過 20 3) DNA的復制的復制細胞外細胞內214) DNA的包裝過程的包裝過程 l l 頭頭尾連接器由尾連接器由12分子分子gpB構成中空結構，構成中空結構，groE1和和groES負責裝配負責裝配 l l pX由由10個雜合的個雜合的gpC和和gpE構成，使連接器定位構成，使連接器定位 l l gpW和和gpF結合在連接器上，防止結合在連接器上，防止DNA外泄，提供尾部外泄，提供尾部粘著點粘著點末端酶末端酶由兩基因產物組成（由兩基因產物組成（Nul和和A），），gpNul2-gpA1 (20,444 x 2 + 72,280 =

20、113,168) 該酶具有以下多種酶活性該酶具有以下多種酶活性：1）特異）特異DNA位點結合；位點結合；2）特異）特異位點切口形成；位點切口形成；3）頭前體結合；）頭前體結合；4）gpFI結合；結合；5）cos位點位點變性；變性；6）DNA轉位；轉位；7）DNA序列掃描；序列掃描；8）ATP結合；結合；9）ATP水解。水解。 因此，頭部蛋白因此，頭部蛋白gpEgpE和和gpDgpD以及包裝蛋白以及包裝蛋白gpAgpA是是DNADNA形成形成噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據這噬菌體顆粒必不可少的組分，體外包裝物的制備就是依據這一結論一結論 22頭-尾連接器gpB gp Nu3g

21、p gro ELgp gro ESgpc.E gpNu3gpE px gpc gpA gpNu1 E.coliE.coli INF Or THFgpFII gpw gpD末端酶復合物II (F1可促進該復合物形成）擴張復合物IDNANu1 左端 ABCNu3DEFIFIIWDNA的包裝的包裝 23 5）DNA作載體的缺點和解決辦法作載體的缺點和解決辦法 i.頭部只能容納自身頭部只能容納自身DNA的的78-105%，即，即39-52.5 Kb，天然天然僅可插入僅可插入3 Kb外源外源DNA片段片段除去所有與除去所有與裂解裂解無關的基因和空白區，最大可插入無關的基因和空白區，最大可插入22 Kb。

22、 ii.同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源同一種限制酶具有多個識別位點，不利于外源DNA插插入入體內突變和建立新的克隆位點。體內突變和建立新的克隆位點。 .重組的重組的DNA分子難于直接導入宿主細胞分子難于直接導入宿主細胞利用體外利用體外包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入包裝成病毒顆粒，然后通過感染的方法注入DNA。 6) 載體的種類載體的種類 i. 插入型插入型即將外源即將外源DNA直接插入已構建載體中，如直接插入已構建載體中，如gt11，可以插入長達，可以插入長達7 Kb的的DNA。這類載體被限制酶。這類載體被限制酶切成左右臂。切成左右臂。 .取代型取代型即利用一段外源即利用一段

23、外源DNA去取代載體中的一段去取代載體中的一段DNA，而這段，而這段DNA常含有一定的標記基因。這類載體常含有一定的標記基因。這類載體常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。常被限制酶切為三段：左臂、隔離段和右臂。 * 有的取代型有的取代型載體亦可用作插入型載體載體亦可用作插入型載體,如如Charon 4A24左臂 隔離段 右臂E Xb E E 50kb lac5 bio256 KH54nin5 QSR80限制酶 克隆方式： EcoRI取代法E E 20.1kb 7.1kbXbI 插入法 Xb Xb 5.64 0大腸桿菌大腸桿菌載體載體Charon 4Ared gamred gamP2 導入

24、外源DNA 取代無噬菌斑+ P2導入滾環復制-Spi 重組子的篩選重組子的篩選 257) 載體的遺傳標記基因和重組子篩選載體的遺傳標記基因和重組子篩選 由于由于載體或重組載體或重組DNA是通過感染途徑進入宿主細胞的，是通過感染途徑進入宿主細胞的，因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標記。用于重組子檢測的因而形成的噬菌斑就是一個明顯的標記。用于重組子檢測的遺傳標記基因主要有遺傳標記基因主要有lacZ 基因。不管是用插入或取代法，該基因。不管是用插入或取代法，該標記基因均會失活。標記基因均會失活。 利用利用spi-選擇重組子選擇重組子：野生型：野生型不能在不能在P2溶源化菌種中成活，溶源化菌種中成活，稱

25、之為稱之為spi+(sensitive to P2 interference)，這與，這與red和和gam基因基因有關。若用外源有關。若用外源DNA將這些基因取代，形成的重組將這些基因取代，形成的重組DNA分子分子可在可在P2菌中株中存活，并形成噬菌斑。菌中株中存活，并形成噬菌斑。載體載體1059、L47.1均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。均屬此類，這種選擇方式亦稱之為顯性選擇。26 2. P1噬菌體載體噬菌體載體 1) 基本結構與特征基本結構與特征 i. 基因組長基因組長88 kb, 在噬菌體顆粒中的在噬菌體顆粒中的DNA長長100 kb, 呈呈線狀線狀,其中約有其中約有12%的多余

26、的多余DNA; ii. 可以低拷貝質粒形式存在于細菌細胞中可以低拷貝質粒形式存在于細菌細胞中, 又可以烈性又可以烈性噬菌體形式進行復制噬菌體形式進行復制; iii. P1噬菌體包裝原理噬菌體包裝原理: 漸進滿頭機制（漸進滿頭機制（processive headful mechanism） 底物底物: 滾環復制過程形成的頭尾相連串狀體滾環復制過程形成的頭尾相連串狀體 27 包裝過程包裝過程: 始于一個長始于一個長162bp的的P1 pac位點位點，識別和切割，識別和切割此位點的是此位點的是P1編碼的編碼的pacase，切出的，切出的pac一端進入預制頭一端進入預制頭部，當其頭部充滿部，當其頭部充

27、滿DNA后，后，DNA再次被切。再次被切。第二次切割第二次切割是隨機的是隨機的，無特異性，無特異性DNA序列。第二輪包裝則從非特異性序列。第二輪包裝則從非特異性切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個切割出的末端開始。因此，多次包裝都是從一個pac位點位點開始的。開始的。P1頭部可容頭部可容110Kb。 pac位點位點: 一端含一端含4個六聚體個六聚體(5 TGATCA/G 3)，另一端，另一端則有三個，中間區域長則有三個，中間區域長90 bp，pacase切點位于靠近切點位于靠近90 bp區的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點區的中心序列。每個六聚體都有一個腺嘌呤甲基化位點(da

28、mGATC), pacase 只作用甲基化的只作用甲基化的pac位點位點.28PacP1基因組(88 kb)大腸桿菌大腸桿菌P1噬菌體基因組和包裝噬菌體基因組和包裝29 2) P1載體載體-pAd10 sacB i. 優點優點 i) 可克隆較大插入片段可克隆較大插入片段, 可插入可插入95Kb外源外源DNA，二倍，二倍于于cos質粒載體質粒載體 ii) 較高的轉化頻率較高的轉化頻率, 12g載體載體 + 24g外源外源DNA105轉化子轉化子 iii) 與與YAC載體相比，它易于產生多拷貝的基因組片載體相比，它易于產生多拷貝的基因組片段段; 易于獲得大量特定的克隆易于獲得大量特定的克隆DNA;

29、 克隆過程更可克隆過程更可靠靠; 克隆片段易于進行次克隆克隆片段易于進行次克隆 ii. 結構結構 載體被二個載體被二個loxP重組位點分隔為兩區重組位點分隔為兩區 Ampr和和Kanr區區 Ampr區：來自區：來自pBR322的的ori, pac位點位點(反時針包反時針包裝裝), 來自腺病毒的來自腺病毒的11Kb填充片段填充片段(插入到插入到Sca位點位點) Kanr 區：區：Kanr(Tn903)和和Tetr基因，基因，P1質粒復制子質粒復制子和分離系統，和分離系統，P1裂解復制子，其活性受裂解復制子，其活性受lac操縱基操縱基因啟動子控制因啟動子控制30E.coli promotersac

30、BP1 repressorbinding siteT7 T3 SalISfiINotI BamHI loxPAmpAd10 pAD10sacBII(29.3 kb)XbaIScaIpacloxPtetlyt Repplasmid Rep kanr大腸桿菌大腸桿菌P1噬菌體載體噬菌體載體p Ad10 sacB 31sacBBamHI+ 95 kb DNA fragment pac loxPsacBKanDNA headful +Cre Recombi- lation DNAAmplifi- cationpac cleavageproteinloxPAmpAd10 pAD10sacBII(29.3

31、 kb)XbaIScaIpacloxPlyt Repplasmid Rep kanrrP1噬菌體載體構建噬菌體載體構建基因組文庫的示意圖基因組文庫的示意圖pAd10 sacB ScaI+BamHI 長臂長臂 + 短臂短臂 加入外源加入外源DNA片段片段 重組重組DNA分子分子 離體包裝離體包裝 感染宿主細胞感染宿主細胞32 SacB基因基因:編碼一種編碼一種將蔗糖轉化為果聚糖的酶將蔗糖轉化為果聚糖的酶，當含該基因，當含該基因的細胞培養在的細胞培養在2%以上蔗糖培養基中時以上蔗糖培養基中時,果聚糖積累在細胞周質空果聚糖積累在細胞周質空間內，導致大腸桿菌細胞死亡間內，導致大腸桿菌細胞死亡 SacB

32、基因被克隆到原基因被克隆到原Tetr 基因的基因的BamHI- SalI間間,在其上游加在其上游加上上E.coli基因啟動子基因啟動子,克隆位點克隆位點BamHI位于這兩個位于這兩個DNA片段間片段間,外源外源DNA片段插入時可進行片段插入時可進行顯性篩選重組子顯性篩選重組子 為了為了使使sacB基因自發突變減小到最小限度基因自發突變減小到最小限度,sacB基因上游還有基因上游還有一個一個P1 C1阻遏物結合位點阻遏物結合位點與其啟動子重疊。與其啟動子重疊。凡是表達凡是表達P1 C1基因基因的細胞，的細胞，sacB基因表達受阻，在無蔗糖條件下，這種細胞會生長基因表達受阻，在無蔗糖條件下，這種細

33、胞會生長得更好得更好 iii. 克隆策略克隆策略 3.3kb短臂短臂：含：含pac,loxP,無啟動子的無啟動子的sacB 26kb長臂長臂: 含含P1裂解復制子，裂解復制子，Kanr，P1質粒復制子，質粒復制子，loxP 位點位點33包裝包裝: 重組重組DNA分子先用分子先用pacase或抽提物或抽提物酶切酶切pac位點，然位點，然后用抽提物后用抽提物（含頭部和尾部）進行包裝直至頭部充滿（含頭部和尾部）進行包裝直至頭部充滿DNA，最后與尾部相連成有感染力的重組，最后與尾部相連成有感染力的重組P1噬菌體顆粒。噬菌體顆粒。 iV. 重組重組DNA分子形成分子形成 當重組當重組DNA分子進入宿主細

34、胞后，特異性位點重組發分子進入宿主細胞后，特異性位點重組發生在兩個方向相同的生在兩個方向相同的loxP位點，該過程由宿主細胞表達位點，該過程由宿主細胞表達的重組酶（的重組酶（Cre）催化）催化 v. 宿主菌宿主菌 E.coli NS3529菌株基因型菌株基因型recA-，lacq，mcrABC，mrr: recA-:防止插入防止插入DNA片段內的同源重組，以免發生重排片段內的同源重組，以免發生重排; lacq : 抑制抑制P1裂解復制子的激活裂解復制子的激活, 使使P1質粒復制子在細質粒復制子在細胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源胞中以單拷貝形式存在，亦防止外源DNA分子重排分子重排; mcr和

35、和mrr: 抑制富含抑制富含GpMeC或或ApMeC插入片段的選擇性丟插入片段的選擇性丟失失34 3. M13和和fd載體載體 1) 結構特征結構特征環狀環狀ssDNA，病毒顆粒呈絲狀，病毒顆粒呈絲狀 2) 復制過程復制過程：ss（+） RF(0-1 min) RF RF(0-20 min) RF ss(+)(20 min)DNA包裝無嚴格限制包裝無嚴格限制 3) 生活史生活史 a. 病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和病毒粒子靠小分子衣殼蛋白和A蛋白附著于性纖毛頂端蛋白附著于性纖毛頂端（E.coli中中F因子提供）因子提供） b. 病毒病毒DNA和和A 蛋白進入細胞內，大部分衣殼蛋白則留在細蛋白進入細

36、胞內，大部分衣殼蛋白則留在細胞膜上胞膜上 c. 病毒病毒DNA變為雙鏈復制形式（變為雙鏈復制形式（RF）, 衣殼蛋白可能為衣殼蛋白可能為DNA復制提供附著位點復制提供附著位點 d. RF進行滾環復制，形成單鏈，同時基因與蛋白質結合進行滾環復制，形成單鏈，同時基因與蛋白質結合 e. ssDNA環化，并形成線狀的環化，并形成線狀的DNA基因與蛋白質復合物基因與蛋白質復合物 f. 病毒病毒DNA穿膜時，基因與蛋白質被附著于膜上的衣殼蛋白穿膜時，基因與蛋白質被附著于膜上的衣殼蛋白取代，完整病毒從細胞中釋放，釋放時不殺死細胞，但因取代，完整病毒從細胞中釋放，釋放時不殺死細胞，但因感染細胞生長緩慢，仍然可

37、見噬菌斑感染細胞生長緩慢，仍然可見噬菌斑35M13噬菌體的生活史噬菌體的生活史 36 1）基因結構基因結構 基因基因、和和編碼特異性蛋白質，參與病毒顆粒的組裝編碼特異性蛋白質，參與病毒顆粒的組裝 基因基因參與參與DNA復制復制 基因基因、和和編碼編碼M13的結構蛋白的結構蛋白 基因基因參與單鏈復制過程中的環化作用參與單鏈復制過程中的環化作用 基因基因是衣殼蛋白的重要組成部分是衣殼蛋白的重要組成部分 2）M13mp系列載體系列載體 a. 特點特點：在：在IR區中插入一個區中插入一個lacZ基因，然后在該基因中逐基因，然后在該基因中逐漸構建一個多克隆位點區，漸構建一個多克隆位點區，ds-DNA可用

38、常規方法直接導入，可用常規方法直接導入，ss-DNA常用感染的方法常用感染的方法 噬菌斑的形成用于選擇噬菌斑的形成用于選擇DNA導入的細胞，在導入的細胞，在X-Gal平板上形成平板上形成的無色噬菌斑檢測重組子的無色噬菌斑檢測重組子 b. 優點優點：易于獲得：易于獲得ss-DNA用于用于DNA序列測定和基因突變，序列測定和基因突變，從細胞中易于檢測分離到從細胞中易于檢測分離到RF型的型的ds-DNA用于外源用于外源DNA重組重組M13mpM13mp系列載體的多克隆位點區系列載體的多克隆位點區 37四四. COS質粒載體質粒載體 1. 結構特點結構特點：在普通質粒載體中插入一個或兩個來自在普通質粒載體中插入一個或兩個來自的的cos位點片段位點片段, 雙雙cos載體比單載體比單cos載體易于重組載體易于重組 l l