1、生物化學（第三版）生物化學（第三版）主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清參編參編 劉文彬劉文彬 李永紅李永紅 姚舜姚舜生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清第十五章第十五章 生物化學與新生物技術生物化學與新生物技術 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因組genome 基因組是生物體內全部遺傳信息的集合 一個物種單倍體的一套染色體DNA生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清幾個代表物種的基因組大小幾個代表物種的基因組大小物種物種基因組大小/bp基因組大小/bpT4噬菌體T4噬菌體2.0102.0105 5大腸桿菌(大腸桿菌(Escherichia

2、coli) )4.2104.2106 6酵母(酵母(Sccharomyces cerevisiae) )1.5101.5107 7擬南芥(擬南芥(Arabidopsis thaliana) )1.0101.0108 8秀麗小桿線蟲(秀麗小桿線蟲(Caenorhbditis elagans) )1.0101.0108 8果蠅(果蠅(Drosophila melanogaster) )1.65101.65108 8水稻(水稻(Oryza sativa) )3.89103.89108 8小白鼠(小白鼠(Mus musculus) )3.0103.0109 9人類(人類(Homo sapiens) )

3、3.3103.3109 9玉米玉米(Zea mays) )5.4105.4109 9普通小麥(普通小麥(Triticum aestivum) )1.6101.6101010生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因組學genomics 發展和應用DNA制圖、測序新技術以及計算機程序，研究生命體（包括人類）全部基因組結構及功能的學科生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因組學研究的最終目標基因組學研究的最終目標u 獲得生物體全部基因組序列獲得生物體全部基因組序列u 鑒定所有基因的功能鑒定所有基因的功能u 明確基因之

4、間的相互作用關系明確基因之間的相互作用關系u 闡明基因組的進化規律闡明基因組的進化規律生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清人類基因組計劃的科學意義在于：（1）確定人類基因組中約5萬個編碼基因的序列及其在基因組中的物理位置，研究基因的產物及其功能。（2）了解轉錄和剪接調控元件的結構與位置，從整個基因組結構的宏觀水平上理解基因轉錄與轉錄后調節。（3）從整體上了解染色體結構，包括各種重復序列以及非轉錄“框架序列”的大小和組織，了解各種不同序列在形成染色體結構、DNA復制、基因轉錄及表達調控中的影響與作用。（4）研究空間結構對基因調節的作用。有些基因的表達調控序列與被調節基因從直線距離

5、上看，似乎相距甚遠，但若從整個染色體的空間結構上看則恰恰處于最佳的調節位置，因此，有必要從三維空間的角度來研究真核基因的表達調控規律。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清（5）發現與DNA復制、重組等有關的序列。DNA的忠實復制保障了遺傳的穩定性，正常的重組提供了變異與進化的分子基礎。局部DNA的推遲復制、異常重組等現象則導致疾病或者胚胎不能正常發育，因此，了解與人類DNA正常復制和重組有關的序列及其變化，將對研究人類基因組的遺傳與進化提供重要的結構上的依據。（6）研究DNA突變、重排和染色體斷裂等，了解疾病的分子機制，包括遺傳性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引發的

6、分子病理學改變及其進程，為這些疾病的診斷、預防和治療提供理論依據。（7）確定人類基因組中轉座子、逆轉座子和病毒殘余序列，研究其周圍序列的性質。了解有關病毒基因組侵染人類基因組后的影響，可能指導人類有效地利用病毒載體進行基因治療。（8）研究染色體和個體之間的多態性。這些知識可被廣泛用于基因診斷、個體識別、親子鑒定、組織配型、發育進化等許多醫療、司法和人類學的研究。此外，這些遺傳信息還有助于研究人類歷史進程、人類在地球上的分布與遷移以及人類與其他物種之間的比較。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清History of the Human Genome Project1990 Off

7、icial start of HGP with 3 billion $ and a 15 year horizon. 1999 Sanger Centre publishes chromosome 222001 Draft Genome published: Celera & Public2003 Completion (almost) of Human GenomeCelera:Craig VenterIntl. Cons:Francis Collins生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清人類基因組計劃HGP生物化學

8、生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 所有的標記都必須具有多態性 由于不能對人類進行“選擇性”婚配，而且人類子代個體數量有限、世代壽命較長，呈共顯多態性的蛋白質數量不多，等位基因的數量不多。 形態標記 細胞學標記 生化標記 DNA分子標記遺傳標記生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清物理圖 物理圖是指以已知核苷酸序列的DNA片段為“路標”，以堿基對（bp，kb，Mb）作為基本測量單位（圖距）的基因組圖。 酵母第三號染色體遺傳圖酵母第三號染色體遺傳圖（右）和物理圖（左）的比較（右）和物理圖（左）的比較生物化學生物化學主編主

9、編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清策略 用機器進行自動測序，一次可讀400800個堿基，由于測定的序列長度有一定限制。 克隆重疊群法 鳥槍法生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清克隆重疊群法克隆重疊群法v 將基因組將基因組DNADNA切割長度為切割長度為0.1Mb0.1Mb1Mb1Mb的大片段，克的大片段，克隆到隆到YACYAC或或BACBAC載體上載體上v 然后再進行亞克隆，分別測定單個亞克隆的序列然后再進行亞克隆，分別測定單個亞克隆的序列v 再裝配、連接成連續的再裝配、連接成連續的DNADNA分子。分子。v 這是一種自上而下（這是一種自上而下（up to downup to do

10、wn）的測序策略）的測序策略 v clone-by-clone methodclone-by-clone method生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清鳥槍法 將較長的基因片段打斷，構建一系列的隨機亞克隆，然后測定每個亞克隆的序列，用計算機分析以發現重疊區域，最終對大片段的DNA定序。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 全基因組鳥槍法測序主要步驟：全基因組鳥槍法測序主要步驟：建立高度隨機、插入片段大小為建立高度隨機、插入片段大小為2kb左右的基因組文庫。克隆數左右的基因組文庫。克隆數要達到一定數量，即經末端測序的克隆片段的堿基總數應達到基要達到一定數量，即經

11、末端測序的克隆片段的堿基總數應達到基因組因組5倍以上。倍以上。高效、大規模的末端測序。對文庫中每一個克隆，進行兩端測序高效、大規模的末端測序。對文庫中每一個克隆，進行兩端測序序列集合。序列集合。填補缺口。有兩種待填補的缺口，一是沒有相應模板填補缺口。有兩種待填補的缺口，一是沒有相應模板DNA的物理的物理缺口，二是有模板缺口，二是有模板DNA但未測序的序列缺口。但未測序的序列缺口。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清測序技術 Sanger雙脫氧鏈終止法 Maxam-Gilbert化學修飾法 高通量測序技術生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清高通量高通量DNA序列分

12、析技術序列分析技術 人類基因組計劃的成功很大程度上得益于有效減少DNA測序成本的技術更新。通過改良測序方法，不斷提升其自動化程度，DNA測序的成本降低了100倍，從20世紀70-80年代$10/bp降低到本世紀初$0.1/bp！ 如果一個熟練的DNA序列分析人員采取早期80年代方法每天測定1000 bp計算，人類基因組（約3109bp）的全序列分析，至少也得需要100名這樣的工人花上100年的時間才能完成。而2000年代的高通量測序儀可達到月測序1-6 Mbp！生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清第二代測序技術 “Next Generation” Roche 454：Pyros

13、equencing Solexa/Illumina：cyclical base addition ABI SOLiD：sequencing by ligation生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清Illumina / Solexa Genome Analyzer2000 Mb / runApplied Biosystems ABI 3730XL1 Mb / day Roche / 454 Genome Sequencer FLX100 Mb / runApplied BiosystemsSOLiD3000 Mb / run生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生

14、物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清功能基因組學功能基因組學 在完成一個生物體全部基因組測序的基礎上，詳盡分析基因在完成一個生物體全部基因組測序的基礎上，詳盡分析基因組的序列，鑒定基因組全部基因的功能，描述各個基因的表組的序列，鑒定基因組全部基因的功能，描述各個基因的表達和調控模式。達和調控模式。 轉錄組學轉錄組學研究某一特殊功能狀態的細胞全套研究某一特殊功能狀態的細胞全套RNA的類型的類型與拷貝數；比較不同功能狀態下與拷貝數；比較不同功能狀態下RNA表達的變化，搜尋與功表達的變化，搜尋與功能狀態變化緊密相關的重要基因群。此研究領域的常用技術能狀態變化緊密相關的重要基因群。此研究

15、領域的常用技術是生物芯片技術。是生物芯片技術。 蛋白質組學蛋白質組學指蛋白質組研究領域，即研究某一特定狀態的指蛋白質組研究領域，即研究某一特定狀態的細胞全套蛋白質表達譜。此研究領域常用技術有蛋白質雙向細胞全套蛋白質表達譜。此研究領域常用技術有蛋白質雙向電泳、飛行質譜、蛋白質芯片技術等。電泳、飛行質譜、蛋白質芯片技術等。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 轉錄組轉錄組指一個細胞內的一套指一個細胞內的一套RNA轉錄物，包含了某一轉錄物，包含了某一環境條件、某一生命階段、某一生理或病理（功能）環境條件、某一生命階段、某一生理或病理（功能）狀態下，生命體的細胞或組織所表達的基因種類和

16、水狀態下，生命體的細胞或組織所表達的基因種類和水平。平。 mRNA 小小RNA：miRNA、siRNA 蛋白質組蛋白質組指一個細胞內的全套蛋白質，即研究某一特指一個細胞內的全套蛋白質，即研究某一特定狀態的細胞全套蛋白質表達譜。此研究領域常用技定狀態的細胞全套蛋白質表達譜。此研究領域常用技術有蛋白質雙向電泳、飛行質譜、蛋白質芯片技術等。術有蛋白質雙向電泳、飛行質譜、蛋白質芯片技術等。 與基因組不同的是，轉錄組、蛋白質組的定義中包含與基因組不同的是，轉錄組、蛋白質組的定義中包含了時間和空間的限定。了時間和空間的限定。 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清轉錄組學基本研究方法 Rea

17、l-time PCR 基于雜交的轉錄組學方法 基因芯片 基于測序的轉錄組學方法 EST 全長cDNA文庫 SAGE 第二代測序技術 生物信息學分析：基因表達聚類生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清生物芯片 在載體材料上，以大規模陣列的形式排布了不同的蛋白質或核酸等生物分子，形成可與目的靶分子相互作用，并進行反應的固相表面。生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清DNA芯片 通過微陣列(Microarray)技術將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的DNA檢測

18、 基因組芯片 表達芯片生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清芯片載體 玻璃片、硅片、尼龍膜、凝膠、金屬 對載體進行化學修飾，活化試劑通過化學反應在載體表面鍵合上活性基團，以便與配基結合，形成具有生物活性的親和表面，用于固定蛋白質和核酸 活化試劑：EDC、NHS 活性基團：氨基、環氧化物、巰基、醛基生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因芯片的探針基因芯片的探針 寡核苷酸寡核苷酸Oligo cDNA：PCR產物產物 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清Spotted Microarrays cDNA Arrays Oligo Arrays In Si

19、tu Oligo Synthesis PhotosynthesisPlaner surfaceMicrofluidics chip E-field synthesisIntegrated Chips Integrated uF, microarray and detection chips with PCR, fluorescence or e-detectionMicrofluidics Plastics Ceramics Silicon Other materials不同的生物芯片技術平臺不同的生物芯片技術平臺點樣芯片原位合成芯片微流體芯片整合型芯片生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵

20、萬海清萬海清點樣芯片點樣芯片非接觸式非接觸式接觸式接觸式 預先合成好的探針通過預先合成好的探針通過類似于噴墨打印機的技類似于噴墨打印機的技術噴射到玻璃基片表面，術噴射到玻璃基片表面，或者用針頭點在片基上。或者用針頭點在片基上。 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清原位合成 激光照排技術光源遮蔽板芯片生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGA Mask 1AAAAA探針合成探針合成生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海

21、清萬海清array probesA 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGC Mask 2CCCCCCAAAAA探針合成探針合成生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清A 33 arrayCGACGACACGAGCGAGCNucleotide Deposition Sequence ACGG Mask 3CCCCCCAAAAAGGGGGGCGACGACGAGCGAGCAC探針合成探針合成完成的芯片完成的芯片生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清L LT TL LL LL LC CL LL

22、LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC

23、CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PL LT TL LL LL LC CL LL LL LL LL LL LL LL LA AC CT TT TT TA AC CC CC CC CC CC CG GC CC CG GA AT TA AT TC CA AT TC CA AT

24、TC CG GA AC CG GA AA AC CT TA AC CT TA AG GC CA AG GC CT TT TO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PO OP PFor growth step: one type of monomer is coupled to specific sites deprotected using PGA.Computer generated light irradiation patterns生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清樣本的處理方法

25、按照樣本分按照樣本分 DNA、RNA、DNA-蛋白復合體 按照標記信號分子劃分按照標記信號分子劃分 熒光染料、生物素、放射性元素 按照標記方法分按照標記方法分 cDNA 直接標記(間接標記)、PCR擴增標記、末端標記生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清芯片實驗流程1、分離RNA（10g）2、標記3、雜交 （預雜交）4、洗片5、掃描6、數據分析生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清Tagged RNA fragments flushed over arrayLaser activation of fluorescent tagsOptical scanning of

26、 hybridization intensities基因芯片的雜交實驗基因芯片的雜交實驗生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清圖像掃描Cy5Cy3生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清差異基因篩選 原理：采用cy3/cy5的ratio值對差異基因進行判斷，或采用統計方法對差異基因進行統計推斷。 倍數法：cy3/cy5比值大于2或者小于0.5生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清基因芯片的應用 基因表達譜分析 基因發現 SNP檢測 藥物基因組學 微生物菌種鑒定 預防醫學研究生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清RNA-Seq 轉錄組測序（全

27、轉錄組鳥槍法測序）：利用深度測序技術對各種類型的轉錄本進行高通量檢測，獲得RNA片段在特定樣本中的含量生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 定量化 可以直接測定每個轉錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準確度，同時不存在傳統微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題 靈敏度高，可以檢測細胞中少至幾個拷貝的稀有轉錄本 可以對任意物種進行全基因組分析，無需預先設計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進行轉錄組分析，同時能夠檢測未知基因，發現新的轉錄本生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質組學 蛋白質組：一個細胞（或組織、機體）所表達的全部

28、蛋白質 蛋白質組學：以蛋白質組為研究對象，研究細胞內所有蛋白質及其動態變化規律的科學 本質是在大規模水平上研究蛋白質特征： 表達水平 （量） 翻譯后的修飾（成熟與調控） 蛋白與蛋白相互作用（信號通路）等 由此獲得蛋白質水平上的關于疾病發生，細胞代謝等過程的整體而全面的認識 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清蛋白質組學研究范疇蛋白質組學研究范疇 蛋白質和蛋白質間相互作用蛋白質和蛋白質間相互作用 蛋白質和核酸之間相互作用蛋白質和核酸之間相互作用 蛋白質及其組成質點的分離、分析、鑒定蛋白質及其組成質點的分離、分析、鑒定 蛋白質結構分析蛋白質結構分析 生理、病理或不同發育狀態下蛋白質

29、組表達差異生理、病理或不同發育狀態下蛋白質組表達差異 蛋白質信息庫蛋白質信息庫生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清研究策略與技術 兩條互補的實驗流程 基于凝膠的工作流程 基于液相色譜的工作流程生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清雙向電泳（2D）生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清 是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合 即先進行等電聚焦電泳（按照pI分離） 然后再進行SDS-PAGE（按照分子大小） 凝膠經染色得到二維分布的蛋白質圖 生物化學生物化學主編主編 張洪淵張洪淵 萬海清萬海清第一向IPG-IEF電泳電泳 固相pH梯度等電聚焦（immobilized pH gradients isoelectric focusing） IEF是一種根據樣品的等電點不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術 將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自