1、實驗九：聚丙烯酰胺凝膠電泳法實驗九：聚丙烯酰胺凝膠電泳法 分離血清蛋白質分離血清蛋白質 實驗目的實驗目的1 1、熟悉電泳的基本原理、熟悉電泳的基本原理2 2、掌握、掌握PAGEPAGE的基本原理與操作技術的基本原理與操作技術具體安排具體安排 上午上午: :制膠、原理講解制膠、原理講解 中午：電泳（午餐）中午：電泳（午餐） 下午：染色，脫色、觀察結果下午：染色，脫色、觀察結果電泳的基本原理電泳的基本原理電泳：電泳： 是指帶電粒子在電場中向著與其所帶相反電是指帶電粒子在電場中向著與其所帶相反電荷的電極方向移動的現象。荷的電極方向移動的現象。應用應用: : 蛋白質蛋白質、核酸和氨基酸等物質的分離和鑒

2、定。、核酸和氨基酸等物質的分離和鑒定。 帶電粒子的運動速度帶電粒子的運動速度-遷移率遷移率 即帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。即帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度。 = Q = Q X /6r/6r Q Q 粒子所帶電荷量粒子所帶電荷量 X X 電場強度電場強度 r r 粒子半徑粒子半徑 介質的粘度介質的粘度 影響電泳速度的因素影響電泳速度的因素1 1、內在因素、內在因素: : 樣品自身性質樣品自身性質2 2、外在因素、外在因素: : 電場電場 緩沖液緩沖液 支持介質支持介質a. a. 電荷電荷b. b. 分子大小分子大小c. c. 形狀形狀v=QX/6r 內因：內因：待分離大分子的性質待

3、分離大分子的性質 電場電場（三要素）（三要素）電流：電流： 與電流成正比與電流成正比電壓：電壓： 與電壓成正比與電壓成正比 常壓電泳（常壓電泳（100-500V100-500V） 高壓電泳（高壓電泳（500-10000V500-10000V）電阻：電阻： 與電阻成反比與電阻成反比 緩沖液緩沖液 pHpH：為電泳提供了恒定的為電泳提供了恒定的pHpH值和適宜的離子強度值和適宜的離子強度解離性質解離性質解離程度解離程度運動方向運動方向電荷量電荷量一般所用離子強度為一般所用離子強度為0.02-0.20.02-0.2之間之間離子強度：離子強度： 強度強度過低過低，緩沖能力差，難以維持，緩沖能力差，難以

4、維持pHpH恒定，同恒定，同 時樣品擴散嚴重；時樣品擴散嚴重； 強度強度過高過高，減緩樣品的遷移率。，減緩樣品的遷移率。支持介質（物）支持介質（物） 吸附吸附: :支持介質對樣品的滯留作用支持介質對樣品的滯留作用, ,可導致樣品的拖尾?？蓪е聵悠返耐衔?。 電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動。電滲：在電場中液體對固體支持物的相對移動。 當電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳當電滲方向與電泳方向一致時，會加快顆粒泳動動 速度；反之，當兩者方向相反時，會減慢顆粒速度；反之，當兩者方向相反時，會減慢顆粒泳泳 動速度。動速度。 分子篩：是凝膠電泳的一個特性。篩孔越小，則顆粒在分子篩：是凝膠電泳的

5、一個特性。篩孔越小，則顆粒在 移動的過程中所受到的阻力也就越大。移動的過程中所受到的阻力也就越大。 電泳分類電泳分類 紙電泳紙電泳 醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜電泳 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGEPAGE） SDS SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳PAGEPAGE實驗原理實驗原理 單體單體交聯劑交聯劑催化劑催化劑加速劑加速劑聚聚CH2CONHCH2NHCOCH2CHCHCH2CONHCH2 分類（根據有無濃縮效應）分類（根據有無濃縮效應） 連續電泳：連續電泳： 電泳體系中緩沖液組成、電泳體系中緩沖液組成、pH值及值及 凝膠孔徑大小都相同

6、。凝膠孔徑大小都相同。 電荷效應、分子篩效應電荷效應、分子篩效應不連續電泳：電泳體系中緩沖液組成、不連續電泳：電泳體系中緩沖液組成、pH值值 及凝膠孔徑大小都不相同。及凝膠孔徑大小都不相同。 電荷效應電荷效應 、分子篩效應、濃縮效、分子篩效應、濃縮效應應不不 連連 續續 電電 泳泳分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠電極緩沖液電極緩沖液凝膠孔徑凝膠孔徑小小大大緩沖體系離緩沖體系離子組成子組成Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HClTris-GlyTris-GlypHpH值值8.98.96.76.78.38.3濃縮效應濃縮效應濃縮膠濃縮膠, ,大孔膠大孔膠, ,Tris-HCl,pH

7、6.7Tris-HCl,pH6.71. 1. 凝膠孔徑的不連續性凝膠孔徑的不連續性2. 2. 緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續性值的不連續性 快離子快離子( (前導離子前導離子): ): 氯離子氯離子 ClCl- - 慢離子慢離子( (尾隨離子尾隨離子): ): 甘氨酸根甘氨酸根 NHNH2 2CHCH2 2COOCOO- - 樣品中蛋白質的泳動速度介于這兩種離子之間樣品中蛋白質的泳動速度介于這兩種離子之間3. 3. 電位梯度的不連續性電位梯度的不連續性_ _ +Tris/甘氨酸甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9分子篩效應分子篩效應 分子大小和形狀不同的蛋

8、白質通過一定孔徑分子大小和形狀不同的蛋白質通過一定孔徑的分離膠時，其受阻滯的程度不同而表現出不同的分離膠時，其受阻滯的程度不同而表現出不同的遷移率。的遷移率。電荷效應電荷效應 進入進入pH8.9pH8.9的分離膠中的分離膠中, ,各種蛋白質所帶凈電荷各種蛋白質所帶凈電荷量不同而有不同的遷移率。表面電荷多量不同而有不同的遷移率。表面電荷多, ,則遷移快則遷移快; ;反之反之, ,則慢則慢. .分離膠（小孔膠）分離膠（小孔膠）pH8.9pH8.9分離膠分離膠, ,濃縮膠濃縮膠實驗操作實驗操作一一、制膠、制膠( (本實驗的關鍵步驟本實驗的關鍵步驟) )1 1、安裝玻板、安裝玻板： 將洗凈的、帶白色邊

9、條的玻板水平放好，將將洗凈的、帶白色邊條的玻板水平放好，將U U型硅膠密封條擺好。然后，將不帶邊型硅膠密封條擺好。然后，將不帶邊條的短玻板蓋在條的短玻板蓋在U U型硅膠密封條上。型硅膠密封條上。 2 2、安裝鐵夾：、安裝鐵夾：用用4 4只鐵夾將安裝好的玻板夾只鐵夾將安裝好的玻板夾好。好。注意：注意：1 1）夾子的作用點應和白色邊條重合，夾子的作用點應和白色邊條重合， 避免夾到邊條內側，造成玻板變形。避免夾到邊條內側，造成玻板變形。 2 2） 玻板下沿的兩個夾子盡量下移，玻板下沿的兩個夾子盡量下移， 使之能夠起到使之能夠起到“腿腿”的作用，保的作用，保證玻板處于直立狀態。證玻板處于直立狀態。 3

10、 3、配制聚丙烯酰胺凝膠、配制聚丙烯酰胺凝膠: : 每種試劑用相應的吸量管、滴每種試劑用相應的吸量管、滴管來吸，吸量管上有標記。管來吸，吸量管上有標記。 不可混用不可混用，否則污染試劑，影響，否則污染試劑，影響實驗結果。實驗結果。 分離膠的配制分離膠的配制小燒杯中按下列順序加入：（小燒杯中按下列順序加入：（B B液有毒性，盡量不液有毒性，盡量不要接觸到皮膚）要接觸到皮膚） 1 1A A液（液（Tris-HClTris-HCl） 1 ml1 ml 2 2B B液（液（Acr-BisAcr-Bis） 2 ml2 ml 3 3蒸餾水蒸餾水 1 ml1 ml 4 4過硫酸銨過硫酸銨 ( (現配）現配）

11、 5 ml5 ml前面四項加完后，混勻前面四項加完后，混勻 5 5TEMED TEMED 1 1滴滴（是加速劑，是加速劑，加入后很快就會凝固，所以最后加，加完后稍事加入后很快就會凝固，所以最后加，加完后稍事混勻就灌注混勻就灌注） 灌注分離膠灌注分離膠將配制好的分離膠輕輕混勻，注意不要產生氣泡將配制好的分離膠輕輕混勻，注意不要產生氣泡快速倒入電泳槽兩玻璃板之間的縫隙中，快速倒入電泳槽兩玻璃板之間的縫隙中，不要產生不要產生氣泡氣泡。液面高度應距離液面高度應距離短玻璃板短玻璃板上緣約上緣約2-32-3厘米厘米左右，上左右，上面灌制濃縮膠。面灌制濃縮膠。灌制完成，放于水平處不要再動，約灌制完成，放于水

12、平處不要再動，約15-2015-20分鐘可分鐘可以聚合（聚合時間與室溫和加樣準確度有關）。以聚合（聚合時間與室溫和加樣準確度有關）。燒杯中的膠不要扔掉燒杯中的膠不要扔掉（化學聚合）（化學聚合）聚膠過程講理論聚膠過程講理論 另一小燒杯中按下列順序加入：（另一小燒杯中按下列順序加入：（D D液有毒性，盡液有毒性，盡量不要接觸到皮膚）量不要接觸到皮膚） 1 1C C液（液（Tris-HClTris-HCl） 0.4 ml0.4 ml 2 2D D液（液（Acr-BisAcr-Bis） 0.8ml0.8ml 3 3E E液液( (核黃素）核黃素） 0.3 ml0.3 ml 4 4過硫酸銨過硫酸銨 0.

13、6 ml0.6 ml 5 5蒸餾水蒸餾水 0.9 ml0.9 ml 混勻混勻 6 6TEMED 1-2TEMED 1-2滴滴 濃縮膠的配制濃縮膠的配制 輕輕混勻，快速傾倒進玻璃板間的縫隙輕輕混勻，快速傾倒進玻璃板間的縫隙, ,液液面高度與矮板相平面高度與矮板相平。插入樣品槽模板插入樣品槽模板（又稱梳子），不要帶進氣泡。（又稱梳子），不要帶進氣泡。整個裝置在紫外線下照射整個裝置在紫外線下照射3030分鐘，使濃縮膠充分鐘，使濃縮膠充分聚合（光聚合）。分聚合（光聚合）。 灌制濃縮膠灌制濃縮膠聚膠過程講理論聚膠過程講理論 每四組配制一份，再分裝成每四組配制一份，再分裝成4 4小份即可。小份即可。 1

14、1血清血清 0.3 ml 0.3 ml （吸血清的吸量管用后要馬上清洗，以免堵塞吸血清的吸量管用后要馬上清洗，以免堵塞） 2 2C C液液 1.0 ml1.0 ml 3 320%20%或或40%40%的蔗糖的蔗糖 3.0 ml3.0 ml 4 40.05%0.05%溴芬蘭溴芬蘭 0.4 ml 0.4 ml （思考（思考2 2：為什么加：為什么加2 2、3 3、4 4這三種液體？這三種液體？） 配制樣品液配制樣品液 安裝電泳槽安裝電泳槽, ,加入電極緩沖液（加入電極緩沖液（ F液）1.1.除去夾子及密封硅膠條除去夾子及密封硅膠條, ,將玻璃夾板、電泳槽內芯、將玻璃夾板、電泳槽內芯、有機玻璃平板依

15、次放入槽內。有機玻璃平板依次放入槽內。( (注意：兩玻璃夾板的注意：兩玻璃夾板的矮板應與電泳槽內芯接觸。矮板應與電泳槽內芯接觸。) )然后插入楔型板以固定然后插入楔型板以固定玻璃夾板。玻璃夾板。2.2. 在外水槽加電泳緩沖液（在外水槽加電泳緩沖液（F F液）至槽體一半的位置，液）至槽體一半的位置，傾斜槽體，使玻璃夾板下沿中的氣泡逸出。放正槽傾斜槽體，使玻璃夾板下沿中的氣泡逸出。放正槽體，繼續加注緩沖液，使體，繼續加注緩沖液，使內外槽內外槽F F液的水位液的水位均超過矮均超過矮板，但不能超過高板板，但不能超過高板。3.3. 將梳子輕輕取出，讓將梳子輕輕取出，讓F F液進入梳子形成的加樣槽中，液進

16、入梳子形成的加樣槽中，準備加樣品。準備加樣品。加樣加樣: :加樣器針尖貼著高玻璃板伸到加樣槽中間位置加樣，針尖不要扎破下面的膠加樣器針尖貼著高玻璃板伸到加樣槽中間位置加樣，針尖不要扎破下面的膠面。面。加樣量加樣量:10 :10 ulul -50 -50 ulul 加樣加樣 電泳電泳 1)1)加樣完畢后，將電泳槽蓋好蓋，與電泳儀相連加樣完畢后，將電泳槽蓋好蓋，與電泳儀相連接。接。 2)2)電泳儀電壓調至最大，電流調到最小，打開電電泳儀電壓調至最大，電流調到最小，打開電泳儀開關進行恒流電泳。泳儀開關進行恒流電泳。 3) 3)濃縮膠濃縮膠:30mA(150V):30mA(150V) 分離膠分離膠:4

17、0mA(200V):40mA(200V)加樣后馬上將微量加樣器仔細沖洗多遍，以免血加樣后馬上將微量加樣器仔細沖洗多遍，以免血清堵塞針尖。清堵塞針尖。 觀察并記錄電泳現象觀察并記錄電泳現象 剝膠：剝膠：拆開電泳槽裝置，用竹鑷子輕輕撬開兩拆開電泳槽裝置，用竹鑷子輕輕撬開兩層玻璃板，戴上一次性手套，用手和鑷子將分層玻璃板，戴上一次性手套，用手和鑷子將分離膠剝離到染色液盤內，離膠剝離到染色液盤內，染色染色1515分鐘。分鐘。 脫色脫色： 將分離膠小心完整地從染色液中移到脫將分離膠小心完整地從染色液中移到脫色液內，脫色三色液內，脫色三次次，每次，每次1010分鐘（每次更換新分鐘（每次更換新鮮脫色液鮮脫色

18、液80-100ml80-100ml），脫色時在搖床上搖。），脫色時在搖床上搖。 八、剝膠、染色八、剝膠、染色、脫色、脫色 點樣線 2 1 清蛋白血清蛋白質醋酸纖維素薄膜血清蛋白質醋酸纖維素薄膜電泳示意圖電泳示意圖 +聚丙烯酰胺凝膠電泳血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳血清蛋白質區帶分布示意圖質區帶分布示意圖PAGEPAGE與醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質比較與醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質比較 影響電泳速度的因素影響電泳速度的因素1 1、內在因素、內在因素: : 樣品自身性質樣品自身性質2 2、外在因素、外在因素: : 電場電場 緩沖液緩沖液 支持介質支持介質不不 連連 續續 電電 泳泳分離膠分離膠濃

19、縮膠濃縮膠電極緩沖液電極緩沖液凝膠孔徑凝膠孔徑小小大大緩沖體系離緩沖體系離子組成子組成Tris-HClTris-HClTris-HClTris-HClTris-GlyTris-GlypHpH值值8.98.96.76.78.38.3濃縮效應濃縮效應濃縮膠濃縮膠, ,大孔膠大孔膠, ,Tris-HCl,pH6.7Tris-HCl,pH6.71. 1. 凝膠孔徑的不連續性凝膠孔徑的不連續性2. 2. 緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pHpH值的不連續性值的不連續性 快離子快離子( (前導離子前導離子): ): 氯離子氯離子 ClCl- - 慢離子慢離子( (尾隨離子尾隨離子): ): 甘氨酸根甘

20、氨酸根 NHNH2 2CHCH2 2COOCOO- - 樣品中蛋白質的泳動速度介于這兩種離子之間樣品中蛋白質的泳動速度介于這兩種離子之間3. 3. 電位梯度的不連續性電位梯度的不連續性_ _ +Tris/甘氨酸甘氨酸 pH 8.3Tris/HCl pH 8.9實驗操作實驗操作2 2、安裝鐵夾：、安裝鐵夾：用用4 4只鐵夾將安裝好的玻板夾只鐵夾將安裝好的玻板夾好。好。注意：注意：1 1）夾子的作用點應和白色邊條重合，夾子的作用點應和白色邊條重合， 避免夾到邊條內側，造成玻板變形。避免夾到邊條內側，造成玻板變形。 2 2） 玻板下沿的兩個夾子盡量下移，玻板下沿的兩個夾子盡量下移， 使之能夠起到使之能夠起到“腿腿”的作用，保的作用，保證玻板處于直立狀態。證玻板處于直立狀態。 3 3、配制聚丙烯酰胺凝膠、配制聚丙烯酰胺凝膠: : 每種試劑用相應的吸量管、滴每種試劑用相應的吸量管、滴管來吸，吸量管上有標記。管來吸，吸量管上有標記。 不可混用不可混用，否則污染試劑，影響，否則污染試劑，影響實驗結果。實驗