1、第三章第三章 動植物細胞培養產酶動植物細胞培養產酶 與微生物細胞相比，動物細胞與微生物細胞相比，動物細胞和植物細胞具有各自不同的特性，和植物細胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培養工藝。需采用各自不同的培養工藝。 一、植物細胞培養產酶一、植物細胞培養產酶 全世界用其制備天然芳香化合物全世界用其制備天然芳香化合物的價值超過的價值超過1515億億/ /年；年；美國用其生產藥物超過美國用其生產藥物超過3030億億/ /年；年；我國使用的中草藥及其制備大部我國使用的中草藥及其制備大部分來自植物；分來自植物；主要生產色素、藥物、香精、酶主要生產色素、藥物、香精、酶等次級代謝物。等次級代謝物。 酶酶

2、植物細胞植物細胞 糖苷酶糖苷酶 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 漆酶漆酶 過氧化物酶過氧化物酶 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 酸性轉化酶酸性轉化酶 堿性轉化酶堿性轉化酶 糖化酶糖化酶 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 苯丙氨酸氨裂合酶苯丙氨酸氨裂合酶 胡蘿卜細胞胡蘿卜細胞 紫苜宿細胞紫苜宿細胞 假挪威槭細胞假挪威槭細胞 甜菜細胞甜菜細胞 利馬豆細胞利馬豆細胞 甜菜細胞甜菜細胞 甜菜細胞甜菜細胞 甜菜細胞甜菜細胞 木瓜細胞木瓜細胞 花生細胞花生細胞 植物細胞發酵產酶植物細胞發酵產酶在在細細胞膜外，由胞膜外，由纖維纖維素素構構成成。功能：功能：1.1.支支持持細細胞，使它有固定胞，使它有固定形形狀狀。2.2.保保護細護細胞

3、胞 葉綠體：葉綠體：內內有有葉葉綠綠素，素，進進行光行光合行用合行用 植物植物細細胞通常有胞通常有較較大的液泡大的液泡 1.1.植物細胞培養植物細胞培養 植物細胞培養植物細胞培養是指在離是指在離體條件下，將愈傷組體條件下，將愈傷組織或其它易分散的組織或其它易分散的組織置于液體培養基中織置于液體培養基中進行振蕩培養，得到進行振蕩培養，得到分散成游離的懸浮細分散成游離的懸浮細胞，通過繼代培養增胞，通過繼代培養增殖，獲得大量細胞的殖，獲得大量細胞的一種技術。一種技術。植物細胞具有的特性植物細胞具有的特性細胞大，細胞壁以纖維素為主要成分，抗剪切細胞大，細胞壁以纖維素為主要成分，抗剪切能力低；能力低；生

4、長速率慢，為防止培養過程中染菌，需加抗生長速率慢，為防止培養過程中染菌，需加抗生素；生素；細胞培養需氧，而培養液粘度大，且不能強力細胞培養需氧，而培養液粘度大，且不能強力通風攪拌；通風攪拌；產物在細胞內且產量低；產物在細胞內且產量低；細胞常生長成各種大小的團塊，增加了懸浮培細胞常生長成各種大小的團塊，增加了懸浮培養的難度等。養的難度等。二、植物細胞培養的特點二、植物細胞培養的特點例如：紫草寧的生產，例如：紫草寧的生產，發酵細胞中的紫草寧比發酵細胞中的紫草寧比紫草根中高紫草根中高1010倍。倍。紫草寧的結構紫草寧的結構（1 1）提高產率）提高產率（2 2）縮短周期）縮短周期發酵周期發酵周期101

5、03030天，種植周期幾個月幾年。天，種植周期幾個月幾年。（3 3）易于管理）易于管理減低勞動強度；不受地理環境和氣候條件等影減低勞動強度；不受地理環境和氣候條件等影響。響。 （4 4）提高產品質量）提高產品質量主要產物濃度高，易于分離純化，減少環境中主要產物濃度高，易于分離純化，減少環境中各種有害物質污染和侵蝕。各種有害物質污染和侵蝕。（5 5）其它）其它設計植物細胞生物反應器和控制工藝條件時應設計植物細胞生物反應器和控制工藝條件時應注意一些問題。注意一些問題。三、植物細胞培養的工藝條件及其控制三、植物細胞培養的工藝條件及其控制（一）植物細胞培養的工藝流程（一）植物細胞培養的工藝流程外植體外

6、植體細胞細胞的獲的獲取取細胞細胞培養培養分離分離純化純化產物產物1、外植體的選擇與處理、外植體的選擇與處理 外植體是指從植株取出，經過預處理后，用于植物組織外植體是指從植株取出，經過預處理后，用于植物組織和細胞培養的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果和細胞培養的植物組織（包括根、莖、葉、芽、花、果實、種子等）的片段或小塊；實、種子等）的片段或小塊；n選擇無病蟲害、生長旺盛的植株；選擇無病蟲害、生長旺盛的植株；n切成小塊，消毒，漂洗切成小塊，消毒，漂洗水稻的外植體（幼胚）水稻的外植體（幼胚）2、植物細胞的獲取、植物細胞的獲取（）直接分離法：通常有機械法、酶解法；（）直接分離法：通常有機械法、酶

7、解法；機械法機械法n具體做法：具體做法：n將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化將葉片輕輕研碎、過濾離心、收集凈化n從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖從未分化的疏松易碎的愈傷組織，通過搖床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團床振蕩獲得分散的單細胞或小細胞團n優點：優點：細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生細胞不受酶傷害；有利于進行細胞的生理和生化研究。化研究。n酶解法酶解法n酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶對細胞壁有一定的軟化作用，所以采用酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑。酶法時，必須加入甘露醇等滲透壓保護劑。n優點優點n可獲得較多的葉肉游離細胞（但對禾本科可獲得較多的葉肉游離細胞（但對

8、禾本科植物葉片效果不好）。植物葉片效果不好）。2、植物細胞的獲取、植物細胞的獲取（）直接分離法，有機械法、酶解法；（）直接分離法，有機械法、酶解法；（）愈傷組織誘導法；（）愈傷組織誘導法；（）原生質體再生法（）原生質體再生法愈傷組織：愈傷組織： 將上述外植體植入誘導培養基中，于將上述外植體植入誘導培養基中，于2525左右培養一段時間，從外植體的切口部位長出左右培養一段時間，從外植體的切口部位長出小細胞團。小細胞團。水稻的愈傷組織（幼胚）水稻的愈傷組織（幼胚）1 1、植物細胞培養基的特點、植物細胞培養基的特點（1 1）需要大量無機鹽，除）需要大量無機鹽，除P P、S S、K K、CaCa、MgM

9、g外，外，還需還需B B、MnMn、ZnZn、MoMo、CuCu、CoCo、I I（2 2）需要多種維生素和植物生長激素，如硫）需要多種維生素和植物生長激素，如硫胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、分裂素等。胺素、吡哆素、煙酸、肌醇、分裂素等。（3 3）一般為無機氮源。）一般為無機氮源。（4 4）一般以蔗糖為碳源。）一般以蔗糖為碳源。（二）植物細胞培養的培養基（二）植物細胞培養的培養基2.2.幾種常用的植物細胞培養基幾種常用的植物細胞培養基3 3、植物細胞培養基的配制、植物細胞培養基的配制（三）溫度的控制（三）溫度的控制室溫（室溫（2525）（四）pHpH值的控制值的控制 微酸性（微酸性（pH5pH56

10、 6）（五）溶解氧的調節控制（五）溶解氧的調節控制代謝慢，耗氧少，對剪切力敏感，攪拌不宜強烈。代謝慢，耗氧少，對剪切力敏感，攪拌不宜強烈。（六）光照的控制（六）光照的控制（七）前體的添加（七）前體的添加提高次級代謝物的產量。提高次級代謝物的產量。（八）刺激劑（八）刺激劑(electior(electior) )的應用的應用強化次級代謝產物的生物合成。常用微生物細胞強化次級代謝產物的生物合成。常用微生物細胞壁碎片和胞外酶。壁碎片和胞外酶。四、植物細胞培養產酶的工藝過程四、植物細胞培養產酶的工藝過程SOD是生物體內清除超氧化物陰是生物體內清除超氧化物陰離子自由基離子自由基(O 2)的重要金屬酶的重

11、要金屬酶類。它和過氧化氫酶、過氧化物類。它和過氧化氫酶、過氧化物酶一起構成了生物體內重要的酶酶一起構成了生物體內重要的酶促反應防御體系，從而維護生物促反應防御體系，從而維護生物體內細胞正常的生理代謝和生化體內細胞正常的生理代謝和生化反應。衰老自由基學說認為衰老反應。衰老自由基學說認為衰老源于機體正常代謝過程中產生過源于機體正常代謝過程中產生過量的自由基對機體損害的結果。量的自由基對機體損害的結果。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)作為能催化作為能催化超氧陰離子發生歧化反應的自由超氧陰離子發生歧化反應的自由基清除劑，具有延緩衰老的作用。基清除劑，具有延緩衰老的作用。天瑞天瑞SOD蘋果蘋果 以

12、大蒜細胞培養生產超氧化物歧化酶（以大蒜細胞培養生產超氧化物歧化酶（SOD）為例）為例(1)(1)大蒜愈傷組織的誘導大蒜愈傷組織的誘導 選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，選取結實、飽滿、無病蟲害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用去除外皮，先用70%70%乙醇消毒乙醇消毒20s20s，再用，再用0.1%0.1%升升汞消毒汞消毒10min10min，然后無菌水漂洗，然后無菌水漂洗3 3次。次。 在無菌條件下，切成在無菌條件下，切成0.5cm0.5cm3 3的小塊，植入的小塊，植入含有含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA 的半固體的半固體MS

13、MS培養基中，在培養基中，在2525，600lux600lux，12h/d12h/d光照條件光照條件下培養下培養18d18d，誘導得到愈傷組織，每，誘導得到愈傷組織，每1818天繼代天繼代一次。一次。(2)(2)大蒜懸浮細胞培養大蒜懸浮細胞培養 將上述在半固體將上述在半固體MSMS培養基上培養培養基上培養18d18d的愈的愈傷組織，在無菌條件下轉入含有傷組織，在無菌條件下轉入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和 1.2mg/L 6-BA 1.2mg/L 6-BA （芐基腺嘌呤）（芐基腺嘌呤） 的液體的液體MSMS培養基中，加入滅菌的玻璃珠，培養基中，加入滅菌的玻璃珠，2525，

14、600lux600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩培養光照條件下震蕩培養18d18d，使，使愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。愈傷組織分散成為小細胞團或單細胞。 然后在無菌條件下，經過篩網將小細胞然后在無菌條件下，經過篩網將小細胞團或單細胞轉入含有團或單細胞轉入含有3mg/L 2,4-D3mg/L 2,4-D和和1.2mg/L 1.2mg/L 6-BA 6-BA 的液體的液體MSMS培養基中，培養基中，25,600lux25,600lux，12h/d12h/d光照條件下震蕩培養光照條件下震蕩培養18d18d。(3)(3)酶的分離純化酶的分離純化 細胞培養完成后，收集細胞，經過細胞細胞

15、培養完成后，收集細胞，經過細胞破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。破碎、提取、分離得到超氧化物歧化酶。二、動物細胞培養產酶二、動物細胞培養產酶 動物細胞可產生較高價值的物質動物細胞可產生較高價值的物質, ,特特別是激素、疫苗，單克隆抗體和酶等動別是激素、疫苗，單克隆抗體和酶等動物功能蛋白。物功能蛋白。動物細胞模式圖一、動物細胞的特性一、動物細胞的特性（1 1）無細胞壁）無細胞壁, ,脆弱脆弱; ;（2 2）體積比微生物細胞大幾千倍）體積比微生物細胞大幾千倍, ,稍小于稍小于植物細胞植物細胞; ;（3 3）具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑）具有群體效應、錨地依賴性、接觸抑制性、功能全能性；制性、

16、功能全能性；（4 4）營養要求復雜。）營養要求復雜。二、二、動物細胞培養的特點動物細胞培養的特點（1）主要用于生產各種功能蛋白質；）主要用于生產各種功能蛋白質；（2）生長緩慢；）生長緩慢；（3）需加抗生素防污染；）需加抗生素防污染；（4）細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感；）細胞體積大，無細胞壁保護，對剪切力敏感；（5）具錨地依賴性，宜貼壁培養；部分用懸浮培養；）具錨地依賴性，宜貼壁培養；部分用懸浮培養；（6）培養基成分復雜，反應過程成本高，產品價格貴）培養基成分復雜，反應過程成本高，產品價格貴 ；（7）原代細胞培養）原代細胞培養50代后，即會退化死亡，需要重新分離細代后，即會退化死亡，需

17、要重新分離細胞。胞。三、動物細胞培養的方式三、動物細胞培養的方式來自血液、淋巴組織來自血液、淋巴組織的細胞、腫瘤細胞、的細胞、腫瘤細胞、雜交瘤細胞等非錨定雜交瘤細胞等非錨定依賴性細胞采用。依賴性細胞采用。類似于微生物細胞的類似于微生物細胞的深層發酵，但工藝條深層發酵，但工藝條件有較大差別。件有較大差別。雜交瘤細胞懸浮培養雜交瘤細胞懸浮培養 （一）懸浮培養（一）懸浮培養細胞懸浮培養法的優點細胞懸浮培養法的優點n可連續收集部分細胞進行移植繼代培養，可連續收集部分細胞進行移植繼代培養，傳代時無需消化分散，免遭酶類、傳代時無需消化分散，免遭酶類、EDTAEDTA及機械損害。及機械損害。n細胞收率高，并

18、可連續測定細胞濃度，細胞收率高，并可連續測定細胞濃度，還有可能實現大規模直接克隆培養。還有可能實現大規模直接克隆培養。 注意事項注意事項n培養過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態，培養過程中，為確保細胞呈單顆粒均勻懸浮狀態，需采用攪拌或氣升式反應器，以較低攪拌速度及需采用攪拌或氣升式反應器，以較低攪拌速度及一定速度通入含一定速度通入含5 5COCO2 2的無菌空氣，保持細胞懸的無菌空氣，保持細胞懸浮態并維持培養液溶解氧。浮態并維持培養液溶解氧。n此外不同細胞懸浮條件亦異，為使細胞不致凝集、此外不同細胞懸浮條件亦異，為使細胞不致凝集、成團或沉淀，在配制培養基的基礎鹽溶液中不加成團或沉淀，在配制

19、培養基的基礎鹽溶液中不加鈣和鎂離子。間歇或連續更換部分培養液，可維鈣和鎂離子。間歇或連續更換部分培養液，可維持持pHpH值，若使用值，若使用HEPESHEPES緩沖鹽溶液時尚可不必連續緩沖鹽溶液時尚可不必連續通入含通入含5 5COCO2 2空氣。空氣。 大多數動物細胞，采用大多數動物細胞，采用: :（1 1）滾瓶培養系統）滾瓶培養系統: :結構簡單結構簡單, ,重現性好重現性好; ;（二）貼壁培養（二）貼壁培養將動物細胞吸附于微載體表面，在培養液中進行將動物細胞吸附于微載體表面，在培養液中進行懸浮培養，使細胞在微載體表面長成單層的培養懸浮培養，使細胞在微載體表面長成單層的培養方法稱為微載體培養

20、法。方法稱為微載體培養法。由葡聚糖凝膠制成微球由葡聚糖凝膠制成微球, ,動物細胞依附其上單層動物細胞依附其上單層生長繁殖生長繁殖, ,懸浮于培養液中懸浮于培養液中; ;特點特點: :比表面積大比表面積大, ,單位體積培養液細胞產率高單位體積培養液細胞產率高; ;具有懸浮培養的優點。具有懸浮培養的優點。（2 2）微載體系統）微載體系統: :制備微載體的材料主要有：制備微載體的材料主要有：n葡聚糖（葡聚糖（DEAEDEAESephadexSephadex A A5050及及A A25 25 ） n塑料塑料n明膠明膠n玻璃玻璃n纖維素纖維素 四、動物細胞培養的工藝條件及其控制四、動物細胞培養的工藝條

21、件及其控制n種質細胞：體細胞、雜交瘤細胞；種質細胞：體細胞、雜交瘤細胞；n工藝過程：工藝過程：種質種質細胞細胞胰蛋白酶胰蛋白酶懸浮懸浮細胞細胞懸浮培懸浮培養或貼養或貼壁培養壁培養收集培收集培養液、養液、分離純分離純化化（一）動物細胞培養基組成成分（一）動物細胞培養基組成成分1 1、氨基酸：各種必需氨基酸，谷氨酰胺等，、氨基酸：各種必需氨基酸，谷氨酰胺等， 作為碳源和能源利用；作為碳源和能源利用；2 2、維生素：血清中，、維生素：血清中，B B族和維族和維C C；3 3、無機鹽：調節滲透壓；、無機鹽：調節滲透壓；4 4、葡萄糖：作為碳源和能源；、葡萄糖：作為碳源和能源；5 5、激素：胰島素、生長

22、激素、氫化可的松；、激素：胰島素、生長激素、氫化可的松；6 6、生長因子：如表皮生長因子、神經生長、生長因子：如表皮生長因子、神經生長 因子、成纖維細胞生長因子。因子、成纖維細胞生長因子。（二）動物細胞培養基的配制（二）動物細胞培養基的配制n首先配制各類母液，使用前混合過濾除菌，首先配制各類母液，使用前混合過濾除菌，使用時稀釋至所需濃度；使用時稀釋至所需濃度；n各種動物培養基已商品化。各種動物培養基已商品化。（三）（三） 溫度的控制溫度的控制一般控制在一般控制在36.536.5;溫度也會影響溫度也會影響pHpH值。值。（四）（四）pHpH值的控制值的控制n一般控制在一般控制在pH7.0pH7.

23、07.6;7.6;n培養過程中需要對培養過程中需要對pHpH值進行監測和調節；值進行監測和調節；n采用采用COCO2 2和和NaHCONaHCO3 3溶液調節溶液調節: :需注意溶解氧的控制；流加酸需注意溶解氧的控制；流加酸堿液；堿液；n加入緩沖系統；加入緩沖系統；n監測指示劑為酚紅。監測指示劑為酚紅。（五）滲透壓的控制（五）滲透壓的控制培養液滲透壓應與細胞內的滲透壓處于等滲狀態。培養液滲透壓應與細胞內的滲透壓處于等滲狀態。（六）溶解氧的控制（六）溶解氧的控制溶解氧的供給對動物細胞培養至關重要；溶解氧的供給對動物細胞培養至關重要；采用調節混合氣體的量與比例的方法。采用調節混合氣體的量與比例的方法。五、動物細胞培養產酶的工藝過程五、動物細胞培養產酶的工藝過程以人黑色素瘤細胞培養生產組織纖溶酶原活化以人黑色素瘤細胞培養生產組織纖溶酶原活化劑劑(tPA(tPA) )為例：為例：tPAtPA是一種絲氨酸蛋白酶是一種絲氨酸蛋白酶, ,可以催化纖溶酶原可以催化纖溶酶原水解，生成纖溶酶水解，生成纖溶酶; ;纖溶酶催化血栓中的血纖纖溶酶催化血栓中的血纖維蛋白水解，對血栓性疾病有顯著療效。維蛋白水解，對血栓性疾病有顯著療效。生產組織纖溶酶原活化劑的工藝過程生產組織纖溶酶原活化劑的工藝過程、人黑色素瘤細胞培養基；