1、核酸分子雜交上核酸分子核酸分子雜交雜交的基本原理的基本原理核酸探針核酸探針核酸分子核酸分子雜交技術(shù)雜交技術(shù)一、一、DNA的變性的變性（denaturation）變性：在變性：在一定的條件下，一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無(wú)規(guī)則的卷曲狀單鏈解離成兩條無(wú)規(guī)則的卷曲狀單鏈DNA分子，此現(xiàn)象稱分子，此現(xiàn)象稱為變性為變性。復(fù)性：復(fù)性：去除變性因素后，單鏈去除變性因素后，單鏈DNA通過(guò)堿基互通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則重新結(jié)合成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一補(bǔ)配對(duì)原則重新結(jié)合成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過(guò)程稱為復(fù)性。過(guò)程稱為復(fù)性。二、二、DNA的復(fù)性的復(fù)性 (renaturatio

2、n) )退火退火淬火淬火 根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，來(lái)源不同的兩條單鏈核酸根據(jù)核酸變性和復(fù)性的原理，來(lái)源不同的兩條單鏈核酸分子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成異源雙鏈雜交體的過(guò)程。分子通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)形成異源雙鏈雜交體的過(guò)程。三、核酸分子雜交三、核酸分子雜交雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的雜交的基礎(chǔ)：核酸分子單鏈之間的堿基互補(bǔ)配對(duì)。堿基互補(bǔ)配對(duì)。注：分子雜交可以在注：分子雜交可以在DNA與與DNA、RNA與與RNA、RNA與與DNA的兩條的兩條單鏈之間進(jìn)行。單鏈之間進(jìn)行。影響核酸分子雜交的因素影響核酸分子雜交的因素四、核酸分子雜交技術(shù)四、核酸分子雜交技術(shù) 通過(guò)標(biāo)記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液通過(guò)標(biāo)記的單

3、鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補(bǔ)靶序列退火形成雙鏈雜交體，而相中單鏈的互補(bǔ)靶序列退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測(cè)特異定性或定量檢測(cè)特異DNADNA或或RNARNA的技術(shù)。的技術(shù)。 第二節(jié)第二節(jié) 核酸探針核酸探針 核酸探針的概念核酸探針的概念 核酸探針的類型核酸探針的類型 核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記 核酸探針的檢測(cè)方法核酸探針的檢測(cè)方法 核酸探針核酸探針( nucleic probe )：指能夠與待測(cè)的靶核酸片段：指能夠與待測(cè)的靶核酸片段互補(bǔ)結(jié)合的帶有特殊可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸片段?；パa(bǔ)結(jié)合的帶有特殊可檢測(cè)標(biāo)記的核苷酸片段。一、概念一、概念按化學(xué)本質(zhì)分：按化學(xué)本質(zhì)分： DNA探針探針

4、 RNA探針探針按標(biāo)記物分：按標(biāo)記物分： 放射性標(biāo)記探針?lè)派湫詷?biāo)記探針 非放射性標(biāo)記探針?lè)欠派湫詷?biāo)記探針二、核酸探針的類型二、核酸探針的類型二、常見(jiàn)核酸探針二、常見(jiàn)核酸探針1.基因組基因組DNA探針探針 2.cDNA探針探針 3.RNA探針探針4.寡核苷酸探針寡核苷酸探針來(lái)源于某種生物的基因組，為某來(lái)源于某種生物的基因組，為某 一基一基因的全部或部分序列。因的全部或部分序列。來(lái)源于來(lái)源于cDNA,不含有內(nèi)含子序列，適用不含有內(nèi)含子序列，適用于基因表達(dá)研究。于基因表達(dá)研究。大多以單鏈形式存在大多以單鏈形式存在,雜交效率高。可雜交效率高?？赏ㄟ^(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得。通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄技術(shù)獲得。用化學(xué)合成技術(shù)

5、在體外合成的單鏈用化學(xué)合成技術(shù)在體外合成的單鏈DNA,長(zhǎng)度一般為長(zhǎng)度一般為20-50bp。三、核酸探針的標(biāo)記三、核酸探針的標(biāo)記 1.核酸探針的標(biāo)記物核酸探針的標(biāo)記物 （1）放射性核素標(biāo)記物）放射性核素標(biāo)記物常用放射性核素標(biāo)記物有：常用放射性核素標(biāo)記物有： 32P、35S、 3H優(yōu)點(diǎn)：靈敏度極高優(yōu)點(diǎn)：靈敏度極高,可檢測(cè)到可檢測(cè)到10-14 10-18g的物質(zhì)，在最適的物質(zhì)，在最適 條件下，可以條件下，可以測(cè)出樣品中少于測(cè)出樣品中少于1000個(gè)分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定個(gè)分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的的物質(zhì)。物質(zhì)。 對(duì)堿基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定性無(wú)影響。對(duì)堿基配對(duì)的特異性和穩(wěn)定

6、性無(wú)影響。 特異性高。特異性高。缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期。缺點(diǎn)：放射性污染，有半衰期。32P或或35S同位素標(biāo)記的單核苷酸同位素標(biāo)記的單核苷酸（）（）（OH）HOH(2)(2)非放射性標(biāo)記物非放射性標(biāo)記物優(yōu)點(diǎn)：無(wú)放射性污染，穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間存放，優(yōu)點(diǎn)：無(wú)放射性污染，穩(wěn)定性好，可以較長(zhǎng)時(shí)間存放， 處理方便。處理方便。缺點(diǎn)：靈敏度、特異性不夠理想。缺點(diǎn)：靈敏度、特異性不夠理想。常用非放射性標(biāo)記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素常用非放射性標(biāo)記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素 2.核酸探針的標(biāo)記方法核酸探針的標(biāo)記方法（一）酶促法（一）酶促法 缺口平移法缺口平移法 隨機(jī)引物法隨機(jī)引物法 DNA探

7、針末端標(biāo)記法探針末端標(biāo)記法（二）（二） 化學(xué)法化學(xué)法預(yù)先標(biāo)記預(yù)先標(biāo)記酶促反應(yīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)移探針探針（1）缺口平移法缺口平移法（nick translation） 由由DNA酶酶和大腸桿和大腸桿菌菌DNA聚合酶聚合酶共同共同完成。完成。酶促法酶促法隨機(jī)引物：含有各種隨機(jī)引物：含有各種可能排列順序的六核可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。苷酸片段的混合物。（2）隨機(jī)引物法（）隨機(jī)引物法（random priming）酶促法酶促法 在在5或或3端通過(guò)酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物端通過(guò)酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段3末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶5末端標(biāo)記法末端標(biāo)記

8、法聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記聚合酶鏈反應(yīng)標(biāo)記DNA探針探針RNA探針的標(biāo)記探針的標(biāo)記寡核苷酸鏈探針的標(biāo)記寡核苷酸鏈探針的標(biāo)記（3）探針的末端標(biāo)記）探針的末端標(biāo)記酶促法酶促法 DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段3末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶酶促法酶促法 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶5末端標(biāo)記法末端標(biāo)記法ATPADP32PT4多核苷酸多核苷酸激酶激酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶酶促法酶促法1.生物素地高辛標(biāo)記核酸探針生物素地高辛標(biāo)記核酸探針2.酶、熒光素標(biāo)記核酸探針酶、熒光素標(biāo)記核酸探針化學(xué)法化學(xué)法生物素化核苷酸生物素化核苷酸生物素生物素 ( biotin ) 標(biāo)記標(biāo)記 光敏生物素標(biāo)記法光敏生物

9、素標(biāo)記法 強(qiáng)光強(qiáng)光10-20分鐘分鐘 光敏生物素的結(jié)構(gòu)光敏生物素的結(jié)構(gòu) 地高辛地高辛 ( digoxigenin ) 標(biāo)記標(biāo)記Dig-11-dUTP的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu) 酶標(biāo)記酶標(biāo)記堿性磷酸酶堿性磷酸酶 辣根過(guò)氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 熒光素標(biāo)記熒光素標(biāo)記 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC） 熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結(jié)合熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結(jié)合四、四、 核酸探針的檢測(cè)核酸探針的檢測(cè)核酸分子雜交反應(yīng)完成后，必須使已標(biāo)記的核酸核酸分子雜交反應(yīng)完成后，必須使已標(biāo)記的核酸探針顯示出可檢測(cè)信號(hào)，方能檢測(cè)未知的待測(cè)核酸探針顯示出可檢測(cè)信號(hào)，方能檢測(cè)未知的待測(cè)核酸序列。序列。 1.

10、放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè) 2.非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè) 1.1.放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)放射性同位素標(biāo)記探針的檢測(cè)（1 1）放射自顯影：利用放射線在）放射自顯影：利用放射線在X X線底片的成影作用來(lái)線底片的成影作用來(lái) 檢測(cè)雜交信號(hào)。檢測(cè)雜交信號(hào)。（2 2）液體閃爍計(jì)數(shù)器：）液體閃爍計(jì)數(shù)器：2.2.非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)非放射性標(biāo)記探針的檢測(cè)（1 1）直接檢測(cè)：雜交反應(yīng)后可以立刻觀測(cè)結(jié)果。如酶）直接檢測(cè)：雜交反應(yīng)后可以立刻觀測(cè)結(jié)果。如酶 和熒光素直接標(biāo)記的探針。和熒光素直接標(biāo)記的探針。（2 2）間接檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)果不能被直接檢測(cè)）間接檢測(cè)：反應(yīng)結(jié)果

11、不能被直接檢測(cè), , 需經(jīng)兩步需經(jīng)兩步 反應(yīng)：與可檢測(cè)系統(tǒng)偶聯(lián)的偶聯(lián)反反應(yīng)：與可檢測(cè)系統(tǒng)偶聯(lián)的偶聯(lián)反 應(yīng)，顯色反應(yīng)。應(yīng)，顯色反應(yīng)。 （1 1）直接檢測(cè)法）直接檢測(cè)法 堿性磷酸酶顯色體系堿性磷酸酶顯色體系 辣根過(guò)氧化物酶顯色體系辣根過(guò)氧化物酶顯色體系酶促顯色法酶促顯色法熒光法熒光法Dig-DNA探針探針 + + 抗抗Dig抗體抗體- -堿性堿性磷酸酶（或辣根磷酸酶（或辣根過(guò)氧化物酶）過(guò)氧化物酶）+ + 底物底物 （2 2）間接檢測(cè)法）間接檢測(cè)法 偶聯(lián)反應(yīng)偶聯(lián)反應(yīng) 顯色反應(yīng)顯色反應(yīng)酶法：通過(guò)酶促反應(yīng)使其底物形成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物酶法：通過(guò)酶促反應(yīng)使其底物形成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物堿性磷酸酶堿性磷酸酶辣根過(guò)

12、氧化物酶辣根過(guò)氧化物酶 DAB（二氨基聯(lián)苯胺）（二氨基聯(lián)苯胺）紅棕色紅棕色TMB（四甲基聯(lián)苯胺）（四甲基聯(lián)苯胺）藍(lán)色藍(lán)色第三節(jié) 核酸分子雜交技術(shù) 印跡雜交 核酸原位雜交 液相印跡雜交固相雜交固相雜交 是將電泳分離的待測(cè)DNA片段固定在固相載體上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交，在與探針有同源序列的位置上顯示雜交信號(hào)的方法。一、傳統(tǒng)的核酸分子雜交技術(shù)一、傳統(tǒng)的核酸分子雜交技術(shù)1 1、Southern 印跡雜交印跡雜交提取提取DNA限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳堿變性堿變性轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤膜，高溫烘烤與與DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影基本步驟基本步驟預(yù)雜交預(yù)雜交圖圖 虹吸印跡法虹吸印跡法 與與Southern Blotting不同的是不同的是：1. 不需要限制性核酸酶切不需要限制性核酸酶切; 2. 變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。醛、甲基氫氧化汞等方法。 檢測(cè)靶分子為檢測(cè)靶分子為RNA RNA極易被環(huán)境中存在的極易被環(huán)境中存在的RNase 降解，提取時(shí)要特別注意降解，提取時(shí)要特別注意RNase 污染問(wèn)題。污染問(wèn)題。2 2、Northern 印跡雜交印跡雜交 3 3、斑點(diǎn)雜交與狹縫斑點(diǎn)雜交與狹縫雜交雜交 將將R