1、核酸分子雜交上核酸分子核酸分子雜交雜交的基本原理的基本原理核酸探針核酸探針核酸分子核酸分子雜交技術雜交技術一、一、DNA的變性的變性（denaturation）變性：在變性：在一定的條件下，一定的條件下，DNA雙螺旋之間的氫鍵斷裂，雙螺旋之間的氫鍵斷裂，解離成兩條無規則的卷曲狀單鏈解離成兩條無規則的卷曲狀單鏈DNA分子，此現象稱分子，此現象稱為變性為變性。復性：復性：去除變性因素后，單鏈去除變性因素后，單鏈DNA通過堿基互通過堿基互補配對原則重新結合成穩定的雙螺旋結構，這一補配對原則重新結合成穩定的雙螺旋結構，這一過程稱為復性。過程稱為復性。二、二、DNA的復性的復性 (renaturatio

2、n) )退火退火淬火淬火 根據核酸變性和復性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸根據核酸變性和復性的原理，來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補配對形成異源雙鏈雜交體的過程。分子通過堿基互補配對形成異源雙鏈雜交體的過程。三、核酸分子雜交三、核酸分子雜交雜交的基礎：核酸分子單鏈之間的雜交的基礎：核酸分子單鏈之間的堿基互補配對。堿基互補配對。注：分子雜交可以在注：分子雜交可以在DNA與與DNA、RNA與與RNA、RNA與與DNA的兩條的兩條單鏈之間進行。單鏈之間進行。影響核酸分子雜交的因素影響核酸分子雜交的因素四、核酸分子雜交技術四、核酸分子雜交技術 通過標記的單鏈核酸探針與固相支持物上或液通過標記的單

3、鏈核酸探針與固相支持物上或液相中單鏈的互補靶序列退火形成雙鏈雜交體，而相中單鏈的互補靶序列退火形成雙鏈雜交體，而定性或定量檢測特異定性或定量檢測特異DNADNA或或RNARNA的技術。的技術。 第二節第二節 核酸探針核酸探針 核酸探針的概念核酸探針的概念 核酸探針的類型核酸探針的類型 核酸探針的標記核酸探針的標記 核酸探針的檢測方法核酸探針的檢測方法 核酸探針核酸探針( nucleic probe )：指能夠與待測的靶核酸片段：指能夠與待測的靶核酸片段互補結合的帶有特殊可檢測標記的核苷酸片段。互補結合的帶有特殊可檢測標記的核苷酸片段。一、概念一、概念按化學本質分：按化學本質分： DNA探針探針

4、 RNA探針探針按標記物分：按標記物分： 放射性標記探針放射性標記探針 非放射性標記探針非放射性標記探針二、核酸探針的類型二、核酸探針的類型二、常見核酸探針二、常見核酸探針1.基因組基因組DNA探針探針 2.cDNA探針探針 3.RNA探針探針4.寡核苷酸探針寡核苷酸探針來源于某種生物的基因組，為某來源于某種生物的基因組，為某 一基一基因的全部或部分序列。因的全部或部分序列。來源于來源于cDNA,不含有內含子序列，適用不含有內含子序列，適用于基因表達研究。于基因表達研究。大多以單鏈形式存在大多以單鏈形式存在,雜交效率高。可雜交效率高。可通過體外轉錄技術獲得。通過體外轉錄技術獲得。用化學合成技術

5、在體外合成的單鏈用化學合成技術在體外合成的單鏈DNA,長度一般為長度一般為20-50bp。三、核酸探針的標記三、核酸探針的標記 1.核酸探針的標記物核酸探針的標記物 （1）放射性核素標記物）放射性核素標記物常用放射性核素標記物有：常用放射性核素標記物有： 32P、35S、 3H優點：靈敏度極高優點：靈敏度極高,可檢測到可檢測到10-14 10-18g的物質，在最適的物質，在最適 條件下，可以條件下，可以測出樣品中少于測出樣品中少于1000個分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定個分子的核酸含量，光譜分析法只能鑒定10-9g的的物質。物質。 對堿基配對的特異性和穩定性無影響。對堿基配對的特異性和穩定

6、性無影響。 特異性高。特異性高。缺點：放射性污染，有半衰期。缺點：放射性污染，有半衰期。32P或或35S同位素標記的單核苷酸同位素標記的單核苷酸（）（）（OH）HOH(2)(2)非放射性標記物非放射性標記物優點：無放射性污染，穩定性好，可以較長時間存放，優點：無放射性污染，穩定性好，可以較長時間存放， 處理方便。處理方便。缺點：靈敏度、特異性不夠理想。缺點：靈敏度、特異性不夠理想。常用非放射性標記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素常用非放射性標記物有：生物素、地高辛、酶、熒光素 2.核酸探針的標記方法核酸探針的標記方法（一）酶促法（一）酶促法 缺口平移法缺口平移法 隨機引物法隨機引物法 DNA探

7、針末端標記法探針末端標記法（二）（二） 化學法化學法預先標記預先標記酶促反應酶促反應轉移轉移探針探針（1）缺口平移法缺口平移法（nick translation） 由由DNA酶酶和大腸桿和大腸桿菌菌DNA聚合酶聚合酶共同共同完成。完成。酶促法酶促法隨機引物：含有各種隨機引物：含有各種可能排列順序的六核可能排列順序的六核苷酸片段的混合物。苷酸片段的混合物。（2）隨機引物法（）隨機引物法（random priming）酶促法酶促法 在在5或或3端通過酶促反應加上標記物端通過酶促反應加上標記物DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段3末端標記法末端標記法T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶5末端標記法末端標記

8、法聚合酶鏈反應標記聚合酶鏈反應標記DNA探針探針RNA探針的標記探針的標記寡核苷酸鏈探針的標記寡核苷酸鏈探針的標記（3）探針的末端標記）探針的末端標記酶促法酶促法 DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段3末端標記法末端標記法限制性內切酶限制性內切酶酶促法酶促法 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶5末端標記法末端標記法ATPADP32PT4多核苷酸多核苷酸激酶激酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶酶促法酶促法1.生物素地高辛標記核酸探針生物素地高辛標記核酸探針2.酶、熒光素標記核酸探針酶、熒光素標記核酸探針化學法化學法生物素化核苷酸生物素化核苷酸生物素生物素 ( biotin ) 標記標記 光敏生物素標記法光敏生物

9、素標記法 強光強光10-20分鐘分鐘 光敏生物素的結構光敏生物素的結構 地高辛地高辛 ( digoxigenin ) 標記標記Dig-11-dUTP的結構的結構 酶標記酶標記堿性磷酸酶堿性磷酸酶 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 熒光素標記熒光素標記 異硫氰酸熒光素（異硫氰酸熒光素（FITC） 熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結合熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架結合四、四、 核酸探針的檢測核酸探針的檢測核酸分子雜交反應完成后，必須使已標記的核酸核酸分子雜交反應完成后，必須使已標記的核酸探針顯示出可檢測信號，方能檢測未知的待測核酸探針顯示出可檢測信號，方能檢測未知的待測核酸序列。序列。 1.

10、放射性同位素標記探針的檢測放射性同位素標記探針的檢測 2.非放射性標記探針的檢測非放射性標記探針的檢測 1.1.放射性同位素標記探針的檢測放射性同位素標記探針的檢測（1 1）放射自顯影：利用放射線在）放射自顯影：利用放射線在X X線底片的成影作用來線底片的成影作用來 檢測雜交信號。檢測雜交信號。（2 2）液體閃爍計數器：）液體閃爍計數器：2.2.非放射性標記探針的檢測非放射性標記探針的檢測（1 1）直接檢測：雜交反應后可以立刻觀測結果。如酶）直接檢測：雜交反應后可以立刻觀測結果。如酶 和熒光素直接標記的探針。和熒光素直接標記的探針。（2 2）間接檢測：反應結果不能被直接檢測）間接檢測：反應結果

11、不能被直接檢測, , 需經兩步需經兩步 反應：與可檢測系統偶聯的偶聯反反應：與可檢測系統偶聯的偶聯反 應，顯色反應。應，顯色反應。 （1 1）直接檢測法）直接檢測法 堿性磷酸酶顯色體系堿性磷酸酶顯色體系 辣根過氧化物酶顯色體系辣根過氧化物酶顯色體系酶促顯色法酶促顯色法熒光法熒光法Dig-DNA探針探針 + + 抗抗Dig抗體抗體- -堿性堿性磷酸酶（或辣根磷酸酶（或辣根過氧化物酶）過氧化物酶）+ + 底物底物 （2 2）間接檢測法）間接檢測法 偶聯反應偶聯反應 顯色反應顯色反應酶法：通過酶促反應使其底物形成有顏色的反應產物酶法：通過酶促反應使其底物形成有顏色的反應產物堿性磷酸酶堿性磷酸酶辣根過

12、氧化物酶辣根過氧化物酶 DAB（二氨基聯苯胺）（二氨基聯苯胺）紅棕色紅棕色TMB（四甲基聯苯胺）（四甲基聯苯胺）藍色藍色第三節 核酸分子雜交技術 印跡雜交 核酸原位雜交 液相印跡雜交固相雜交固相雜交 是將電泳分離的待測DNA片段固定在固相載體上，與標記的核酸探針進行雜交，在與探針有同源序列的位置上顯示雜交信號的方法。一、傳統的核酸分子雜交技術一、傳統的核酸分子雜交技術1 1、Southern 印跡雜交印跡雜交提取提取DNA限制性內切酶消化限制性內切酶消化瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳堿變性堿變性轉移到轉移到NC膜，高溫烘烤膜，高溫烘烤與與DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影基本步驟基本步驟預雜交預雜交圖圖 虹吸印跡法虹吸印跡法 與與Southern Blotting不同的是不同的是：1. 不需要限制性核酸酶切不需要限制性核酸酶切; 2. 變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲變性方法不是堿變性，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。醛、甲基氫氧化汞等方法。 檢測靶分子為檢測靶分子為RNA RNA極易被環境中存在的極易被環境中存在的RNase 降解，提取時要特別注意降解，提取時要特別注意RNase 污染問題。污染問題。2 2、Northern 印跡雜交印跡雜交 3 3、斑點雜交與狹縫斑點雜交與狹縫雜交雜交 將將R