1、第一頁，共47頁。高效液相色譜法的特點高效液相色譜法的特點 （1）高壓高壓：150-350105 Pa：液相色譜法以液體為流動相（稱為：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。必須對載液施加高壓。 （2）高速高速：通常小于：通常小于1h。（可達。（可達1-10mL/min30mL/h。）（。）（3）高效高效：大于：大于30000塔板塔板/米米普通填充柱效普通填充柱效1000塔板塔板/m.近來研近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。究出許多新型固定相，使分離效

2、率大大提高。 （4）高靈敏高靈敏：10-9g （紫外檢測）、（紫外檢測）、10-11g （熒光檢測）（熒光檢測） 第二頁，共47頁。第三頁，共47頁。第四頁，共47頁。理理nLH/22212)(16)(54. 5)(WtWttnRRR理effeffnLH/ 2212)(54. 5)(16WtWtnRReff0ttkR2)1(kknneff理第五頁，共47頁。（填充柱）：uCuBAHGC/（毛細管柱）或uCuBH/pdA2pdAgmDDB22gRDBtB，MTDTDgg或llgsmCCCCCCllDdfC2TDL第六頁，共47頁。為什么？）（忽略縱向擴散項：,uCAHHPLCRtnHuuHscm

3、u，但柱效，時，/1min/1mlu 選擇兼顧柱效和分析時間，dpA2dpA柱效，nHAdp?0uDCHmdd第七頁，共47頁。第八頁，共47頁。ssmmCCCCuCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，但易產生氣泡mmDTCDT第九頁，共47頁。pedH2uDdCHsfss2uDdCHmpsmsm2uDdCHmpmm2第十頁，共47頁。22114kknRuCAH流動相采用粘度小、低流速的勻的固定相：采用粒度小、填充均n12121212RRRRVVttkkKK溫影響小）質和固定相性質（受柱：調整流動相種類、性0ttVVKVCVCWW

4、kRmsmmssms小）的配比（受柱溫影響較：調整流動相和固定相k第十一頁，共47頁。第十二頁，共47頁。根據分離機制的不同，高效液相色譜法可分為下述幾種主要類型：1 液 液分配色譜法流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶，有一個明顯的分界面。溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從于下式：smmsVVkCCK第十三頁，共47頁。液-液分配色譜與氣-液分配色譜異同：同：分離的順序決定于分配系數的大小，分配系數大的組分保留值大。異：液相色譜中流動相的種類對分配系數的影響很大，氣相色譜中流動相性質對分配系數影響不大。第十四頁，共47頁。液液色譜法中，為避免固定液流失，對于親水性固定液常

5、采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性，這種情況稱為正相液-液色譜法。若流動相極性大于固定相極性，則稱為反相液液色譜法。其出峰順序與正相液液色譜法相反。色譜分離過程中，由于固定液在流動相中仍有微量溶解，以及流動相通過色譜柱時的機械沖擊，固定液不斷流失而導致保留行為的變化，柱效和分離選擇性變壞等不良后果，為更好的解決固定液從載體上流失的問題，將各種不同的有機基團通過化學反應共價鍵合到硅膠（擔體）表面的游離羥基上，代替機械涂漬的液體固定相，從而產生了化學鍵合固定相。！反相化學鍵合相色譜法，在高效液相色譜法中應用廣泛。第十五頁，共47頁。2 液 固色譜法流動相為液體，固定相為吸附劑。這是根

6、據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是溶質分子 (X) 和溶劑分子（S）對吸附劑活性表面的競爭吸附。若溶劑分子吸附性更強，則被吸附的溶質分子將相應地減少。吸附劑對分配系數大的組分吸附力強，相應的保留值也大。 適用于分離相對分子質量中等的油溶性試樣，對具有不同官能團的化合物和異構體有較高的選擇性。缺點：非線性等溫吸附會引起峰拖尾現象。第十六頁，共47頁。3 離子對色譜法離子對色譜法離子對色譜法是將一種離子對色譜法是將一種 ( 或多種或多種 ) 與溶質分子電荷相與溶質分子電荷相反的離子反的離子 ( 稱為對離子或反離子稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，加到流動相或固定相中，使其與

7、溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。溶質離子的保留行為。流動相中待分離的有機離子流動相中待分離的有機離子X+（或帶負電荷的離子）與固（或帶負電荷的離子）與固定相或流動相中帶相反電荷的對離子定相或流動相中帶相反電荷的對離子Y-結合，形成離子對化結合，形成離子對化合物合物X+ Y- ，然后在兩相間進行分配。，然后在兩相間進行分配。 YX Y -K-XY有機相水相水相X第十七頁，共47頁。平衡常數 KXY水相水相有機相YX-YXKXY溶質分配系數 DX水相水相有機相YKX-XYYXDX離子對色譜法離子對色譜法（流動相和固定

8、相）正相離子對反相離子對反相離子對極性流動相（含Y-）（甲醇-水，乙腈-水等）試樣離子X+疏水性離子對X+Y-X+Y-在固定相表面分配吸附。第十八頁，共47頁。容量因子k1水相YKVVDkXYMSX滯留因子：Rs=1/(1+k)=us/u, tR=L/us）水相11 (YKuLtXYR可用于生化試樣（核酸、核苷、兒茶酚胺、生物堿及藥物等分離。可在離子對生成時，引入紫外吸收或熒光基團，從而提高檢測靈敏度。第十九頁，共47頁。4. 離子交換色譜法離子交換色譜法是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。凡是在溶劑中

9、能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。5. 離子色譜法用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。洗脫反應則為交換反應的逆過程.第二十頁，共47頁。6 空間排阻色譜法空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似于分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱后，隨

10、流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子， 首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔并滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最后出現。 可用于在流動相中可溶的，分子質量差別在10%以上的分子。第二十一頁，共47頁。液 - 液色譜法、鍵合色譜法及離子對色譜法固定相所用的擔體可分為如下幾類： 全多孔型擔體是顆粒均勻的多孔球體。 100m表層多孔型擔體 又稱薄殼型微珠擔體。從開始的直徑為 30 40 m 的實心核 ( 玻璃微珠 ) ，表層上附有一層厚度約為 1 2m 多孔表面 ( 多孔硅膠 ) 。 目前多為5-10

11、m的全多孔微粒擔體，缺點：固定液機械涂附在擔體上，固定液流失不可避免。為克服此缺點，出現新型固定相化學鍵合固定相化學鍵合固定相 第二十二頁，共47頁。(3) 化學鍵合固定相 即用化學反應的方法通過化學鍵把有機分子結合到擔體表面。根據在硅膠表面 ( 具有 Si OH 基團 ) 的化學反應不同，鍵合固定相可分為：硅氧碳鍵型 ( Si O C ) ；硅氧硅碳鍵型 ( SiOSiC ) 硅碳鍵型（ SiC ）和硅氮鍵型（ SiN ）四種類型。 化學鍵合固定相具有如下一些特點： . 表面沒有坑，比一般液體固定相傳質快得多； . 無固定液流失，增加了色譜柱的穩定性和壽命； . 可以鍵合不同官能團，能靈活地

12、改變選擇性，應用于多種色譜類型及樣品的分析； . 有利于梯度洗提，也有利于配用靈敏的檢測器和餾分的收集。 第二十三頁，共47頁。化學鍵合相色譜應用第二十四頁，共47頁。第二十五頁，共47頁。第二十六頁，共47頁。第二十七頁，共47頁。2 液固吸附色譜法固定相采用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。分為全多孔型和薄殼型。目前多為5-10m全多孔型硅膠微粒3 離子交換色譜法固定相（ 1 ）薄膜型離子交換樹脂即以薄殼玻珠為擔體，在它的表面涂約 1% 的離子交換樹脂而成。 （ 2 ）離子交換鍵合固定相用化學反應將離子交換基團鍵合在惰性擔體表面。4 排阻色譜法固定相（ 1 ）軟質凝膠如葡聚糖凝膠、

13、瓊脂糖凝膠等，適用于水為流動相。 （ 2 ）半硬質凝膠如苯乙烯二乙烯基苯交聯共聚凝膠（交聯聚苯乙烯凝膠）是應用最多的有機凝膠，適用于非極性有機溶劑。 （ 3 ）硬質凝膠如多孔硅膠、多孔玻珠等，多孔硅膠是用得較多的無機凝膠。 第二十八頁，共47頁。第二十九頁，共47頁。高效液相色譜儀典型結構示意圖第三十頁，共47頁。（） 往復式柱塞泵 當柱塞推入缸體時，泵頭出口（上部）的單向閥打開，同時，流動相進入的單向閥（下部）關閉，這時就輸出少量的流體。反之，當柱塞向外拉時，流動相入口的單向閥打開，出口的單向閥同時關閉，一定量的流動相就由其儲液器吸入缸體中。這種泵的特點是不受整個色譜體系中其余部分阻力稍有變

14、化的影響，連續供給恒定體積的流動相。第三十一頁，共47頁。（2）氣動放大泵 其工作原理是：壓力為 p1 的低壓氣體推動大面積（ SA ）活塞 A ，則在小面積（ SB ）活塞 B 輸出壓力增大至 p2 的液體。壓力增大的倍數取決于 A 和 B 兩活塞的面積比，如果 A 與 B 的面積之比為 50 : 1 ，則壓力為 5 105Pa的氣體就可得到壓力為 250 105Pa的輸出液體。這是一種恒壓泵。第三十二頁，共47頁。2 梯度洗提梯度洗提，就是載液中含有兩種（或更多）不同極性的溶劑，在分離過程中按一定的程序連續改變載液中溶劑的配比和極性，通過載液中極性的變化來改變被分離組分的分離因素(容量因子

15、和選擇性因子），以提高分離效果。梯度洗提可以分為低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下預先按一定的程序將溶劑混合后再用泵輸入色譜柱。高壓梯度 ( 或稱內梯度系統 ) ：將溶劑用高壓泵增壓后輸入色譜系統的梯度混合室，混合后送入色譜柱。第三十三頁，共47頁。第三十四頁，共47頁。第三十五頁，共47頁。 第三十六頁，共47頁。液相色譜儀操作視頻資料液相色譜儀操作視頻資料第三十七頁，共47頁。如何應用高效液相色譜對試樣分離、分析：因綜合考慮各種因素：試樣的性質（相對分子質量、化學結構、極性、溶解度等化學和物理性質）。液相色譜分離類型的特點及應用范圍。實驗室條件（儀器、色譜柱等）1.第三十八頁，共47頁。液相

16、色譜分離類型選擇參考表第三十九頁，共47頁。簡單分析教材中提到的實例，解釋原因。第四十頁，共47頁。第四十一頁，共47頁。1.色譜柱柱容量（柱負載）：分析型色譜柱柱容量：指在不影響柱效能情況下最大進樣量。通常進樣量小于1mg/g吸附劑，保留值k和柱效H不隨進樣量改變而變化。超過此進樣量，色譜柱超載，柱效大幅度降低，峰形變寬，分離度變差，保留值也發生變化。進樣量越大柱效越低，分離度越差，是制備色譜主要限制之一。制備色譜柱柱容量：指在不影響收集物純度前提下最大進樣量。制備柱允許過載，但柱效降低不宜過半或容量因子中減少超過10%。第四十二頁，共47頁。第四十三頁，共47頁。2. 液相制備色譜方法A、欲分離組分呈現一個單峰n在分析型HPLC上進行試驗，n利用色譜分離基本方程，通過k、，n值的優化提高分離度。n增加進樣量直到色譜峰發生重疊，在柱負荷極限內，擴大柱徑，以提高允許最大試樣量，并擴大輸液泵流量，分離出純組分。n若要獲得更大量的純物質，可使柱超載運行，此時產生峰重疊，按中心切割法收集少量餾分，以分析