1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上ELISA灰區(qū)的設(shè)置及質(zhì)控方法ELISA測(cè)定的陽性判斷值，通常是將大量陰性和陽性人群的測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后確定的，其確定依據(jù)為判斷結(jié)果的假陽性和假陰性率最低。在陽性判斷值周圍一定范圍內(nèi)之外的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，亦即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。“灰區(qū)”的大小可用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定。測(cè)定結(jié)果處于“灰區(qū)”的樣本，可通過確認(rèn)試驗(yàn)或追蹤檢測(cè)來確定到底是陽性還是陰性。”。“灰區(qū)”的大小可用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法確定?具體是怎么確定的，。或者大概粗略的方法計(jì)算是怎么樣的呢？高手在哪呢ELISA“灰區(qū)”是把定量分析的正常值范圍引入定性分析而建立的概念。灰區(qū)的設(shè)置有二種：（1）C.O×（1&

2、#177;C）， C為該試劑的批內(nèi)C (一般在15-20%間）；（2）C.O±2S，S為實(shí)驗(yàn)室做室內(nèi)質(zhì)控ROC的S。另外，個(gè)人認(rèn)為：ELISA“灰區(qū)”對(duì)于不同項(xiàng)目和應(yīng)用的領(lǐng)域不同,其設(shè)置不能一概而論。根據(jù)美國(guó)疾病控制中心（CDC）對(duì)美國(guó)Ortho的抗HC檢測(cè)的ELISA試劑盒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)只有檢驗(yàn)結(jié)果S/CO3.8時(shí)，高度預(yù)示HC抗體真陽性狀態(tài)；若檢驗(yàn)結(jié)果S/CO<3.8，存在較高的假陽性。 在血站系統(tǒng)的獻(xiàn)血員抗HC篩查用上述兩種灰區(qū)的設(shè)置方法沒有什么不可；如果臨床實(shí)驗(yàn)室抗HC的灰區(qū)也按前者設(shè)置，勢(shì)必存在較多的假陽性，如何設(shè)置灰區(qū)應(yīng)該是值得研究和商榷的。這位老師好，不好意思，本

3、人愚昧，還不是很清楚這兩種方法在實(shí)際的應(yīng)用，可否舉一個(gè)小例子。比如HBsAg>0.5是陽性，如果測(cè)量得吸光度是0.4的話怎么判斷，結(jié)果是陰性，但是是有很明顯顏色的。在血站系統(tǒng)這樣的血就不敢用，怎么解決呢，我們經(jīng)常遇到測(cè)量陰性但是有顏色的標(biāo)本，用不同廠家的試劑或是同種試劑重復(fù)實(shí)驗(yàn)還是一樣，又擔(dān)心存在弱抗體的問題。怎么解決呢，萬分感激國(guó)內(nèi)試劑測(cè)HBSAG的cutoff值一般不會(huì)達(dá)到0.5，除非不做空白。其cutoff的公式一般為NC*2.1。我只是舉例。別找問題以外的事情來說呀，我等答案等得著急第三章ELISA技術(shù)的質(zhì)量控制概述Engall和Perlmann于1971年首先建立了酶聯(lián)免疫吸附

4、試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）。隨著科技的發(fā)展，ELISA在抗原、抗體、酶、固相載體及包被技術(shù)等方面都有較大的進(jìn)步，其靈敏度和特異性均大大提高。由于該技術(shù)具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，因而已被廣泛應(yīng)用于各行業(yè)。盡管如此，ELISA在應(yīng)用過程中仍然存在著許多難點(diǎn)，必須嚴(yán)格控制才能保證檢測(cè)的質(zhì)量。ELISA質(zhì)量保證是一個(gè)復(fù)雜的過程，許多重要的環(huán)節(jié)都影響到檢測(cè)的質(zhì)量。現(xiàn)分述如下：一、方法學(xué)的影響ELISA測(cè)定模式包括以下幾種：雙抗體夾心法、間接法、雙抗原夾心法、IgM抗體捕捉法、競(jìng)爭(zhēng)抑制法，其中競(jìng)爭(zhēng)抑制法因受操作時(shí)差所引起的不公平競(jìng)爭(zhēng)等因素的影響

5、，結(jié)果重復(fù)性較差，質(zhì)量較難控制。二、試劑因素1.試劑的選擇免疫檢測(cè)的原理均基于抗原抗體反應(yīng)。由于該反應(yīng)過程受多種因素的影響，如普遍存在基質(zhì)效應(yīng)、交叉反應(yīng)等，因而檢測(cè)結(jié)果難以溯源，不同方法、不同試劑之間甚至同一試劑不同批號(hào)間結(jié)果均缺乏可比性。試劑質(zhì)量在很大程度上決定了檢測(cè)的水平，因此在引入新項(xiàng)目之前必須對(duì)試劑進(jìn)行嚴(yán)格的評(píng)估。試劑的評(píng)估有以下幾個(gè)步驟：確定開展該項(xiàng)目的必要性；了解該項(xiàng)目現(xiàn)有的檢測(cè)方法和原理；在了解試劑的組成基礎(chǔ)上選擇多家試劑盒進(jìn)行比較，判斷標(biāo)準(zhǔn)首選參考方法或參考物質(zhì)，其次為臨床的滿意度及權(quán)威機(jī)構(gòu)的報(bào)告如各級(jí)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)、CDC報(bào)告等；定期對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行追蹤反饋直至最終認(rèn)可該試劑。2

6、.試劑的準(zhǔn)備不同批次的ELISA試劑在制作過程中很難保證質(zhì)量完全一致，即使是通過批批檢的項(xiàng)目其檢測(cè)結(jié)果也存在差異，因此必須選擇和訂購長(zhǎng)批號(hào)的試劑，并保證保存條件。嚴(yán)格執(zhí)行這一標(biāo)準(zhǔn)可以避免因試劑批號(hào)改變而重新建立質(zhì)控體系及重新評(píng)估試劑的復(fù)雜過程，并且能夠保證結(jié)果的穩(wěn)定性；對(duì)于效期短、使用率低的試劑，應(yīng)當(dāng)小量分裝，每次使用則取分裝部分即可，避免反復(fù)凍融造成試劑的失效。試劑使用前必須平衡至室溫，否則會(huì)影響檢測(cè)下限。未用完的室內(nèi)質(zhì)控品及本次不需使用的試劑應(yīng)密封并及時(shí)放回冰箱保存。三、樣本因素標(biāo)本干擾因素包括內(nèi)源性干擾因素和外源性干擾因素，前者包括類風(fēng)濕因子、補(bǔ)體、異嗜性抗體、自身抗體、溶菌酶等，后者包

7、括標(biāo)本溶血、標(biāo)本被細(xì)菌污染、標(biāo)本貯存時(shí)間過長(zhǎng)、標(biāo)本凝固不全、冷凍標(biāo)本的反復(fù)凍融等。其中外源性干擾因素是我們?cè)跈z測(cè)過程中可以避免也是必須避免的因素，而避免內(nèi)源性因素的干擾則主要通過選擇合適的試劑盒。在臨床中遇到少見的疑難病例時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮到內(nèi)源性干擾因素的存在。以下對(duì)外源性干擾因素進(jìn)行簡(jiǎn)要說明：1.標(biāo)本溶血 要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其具有類過氧化物的活性，因此，在以辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如果血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的底物反應(yīng)顯色。2.標(biāo)本被細(xì)菌污

8、染 標(biāo)本的采集及血清分離要注意盡量避免細(xì)菌污染。細(xì)菌菌體中除可能含有內(nèi)源酶對(duì)測(cè)定產(chǎn)生非特異性干擾外，還可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用。另外標(biāo)本在保存中出現(xiàn)渾濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。3.標(biāo)本貯存時(shí)間過長(zhǎng) 標(biāo)本在低溫下保存時(shí)間過長(zhǎng)，IgG可聚合成多聚體，在間接法ELISA測(cè)定中會(huì)導(dǎo)致本底加深、甚至出現(xiàn)假陽性結(jié)果。通常情況下血清標(biāo)本可在28下保存l周，冷凍保存時(shí)間會(huì)更長(zhǎng)，但對(duì)于抗體或抗原含量低的標(biāo)本而言，則可能會(huì)因抗體掉價(jià)、抗原分解而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。4.標(biāo)本凝固不全 血液通常在采集后半小時(shí)后開始凝固，1824h完全凝固。如果在血液未凝固時(shí)即離心分離血清，則可因纖維蛋白原非特異吸附于微

9、孔而造成假陽性結(jié)果。為了縮短標(biāo)本處理時(shí)間，可以在離心前將血液標(biāo)本置于溫箱中溫育或者采用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當(dāng)?shù)拇倌齽┮约铀傺宓姆蛛x。5.冷凍保存標(biāo)本避免反復(fù)凍融 標(biāo)本的反復(fù)凍融會(huì)因其所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，使抗體效價(jià)跌落從而引起假陰性結(jié)果，所以測(cè)抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測(cè)，宜少量分裝凍存。此外，標(biāo)本在凍存時(shí)會(huì)因蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均，因此重新融解的標(biāo)本必須混勻，但不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒即可。四、操作因素對(duì)ELISA結(jié)果的影響ELISA測(cè)定一般遵循以下步驟：固相包被加樣品溫育洗滌加酶結(jié)合物溫育洗滌加底物溫育顯色終止顯色比色目前各種形式的EL

10、ISA自動(dòng)分析儀已經(jīng)進(jìn)入市場(chǎng)，如廣泛應(yīng)用于血站系統(tǒng)的微板式全自動(dòng)酶免分析儀，其試劑為開放式的，而對(duì)于其它類型的儀器，則試劑和儀器往往是配套的。但當(dāng)前大部分醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室均采用手工操作加儀器測(cè)定的方式。ELISA操作步驟復(fù)雜，操作不當(dāng)將引起較大的誤差。以下敘述各個(gè)步驟中的影響因素。1.加樣加樣器是一種比較精密的工具，其在長(zhǎng)時(shí)間使用時(shí)會(huì)因機(jī)械磨損或者推動(dòng)桿內(nèi)附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)，尤其是對(duì)于樣本量較大的臨床實(shí)驗(yàn)室，因此必須定期對(duì)加液器進(jìn)行維護(hù)和校準(zhǔn)。每次加不同的標(biāo)本時(shí)均需更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染。加樣時(shí)速度不可太快，避免將標(biāo)本加在孔壁上部 ，并注意不要濺出或產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)還應(yīng)當(dāng)注意操作時(shí)差對(duì)結(jié)

11、果的影響，操作時(shí)差是指加入標(biāo)本、試劑及混勻時(shí)間的差異。操作時(shí)差在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都存在，尤其是手工操作，日常檢測(cè)標(biāo)本多達(dá)幾百個(gè)，從加入第一個(gè)標(biāo)本到最后一個(gè)標(biāo)本，需幾十分鐘，加入試劑及混勻等均存在著前后的時(shí)間差異，使抗原抗體反應(yīng)和酶促反應(yīng)時(shí)間不一致，操作時(shí)差對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)的結(jié)果影響更大，在加酶結(jié)合物和底物時(shí)可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。如果使用滴瓶除注意滴加的角度外還要注意滴加的速度，速度太快，容易出現(xiàn)重復(fù)滴加或者加在兩孔之間，造成非特異性吸附。另外有些項(xiàng)目在檢測(cè)前需要稀釋以減低非特異性反應(yīng)，但稀釋的方式非常重要，如果采用手工稀釋則容易因操作者個(gè)體差異而產(chǎn)生不一致的結(jié)果，尤其是吸光度處于臨界值

12、附近的標(biāo)本，因此最佳的方式是采用振蕩器混勻。2.溫育在 ELISA檢測(cè)中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過程稱為溫 育(incubation)。溫育常采用的溫度有 43、37、室溫和4（冰箱溫度）等。37是實(shí)驗(yàn)室中常用的溫育溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的最適反應(yīng)溫度。有實(shí)驗(yàn)表明，抗原抗體反應(yīng)一般在37經(jīng)12小時(shí)產(chǎn)物的生成可達(dá)頂峰。為加速反應(yīng)，可在一定范圍內(nèi)提高反應(yīng)的溫度并在反應(yīng)過程中連續(xù)振蕩以增加抗原抗體接觸的機(jī)會(huì)。抗原抗體反應(yīng)在4反應(yīng)更為徹底，形成的產(chǎn)物更多更穩(wěn)定，但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA檢測(cè)中一般不予采用。溫育的方式有

13、溫箱法、微波輻射法、水浴法等，其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（這種現(xiàn)象被稱為“邊緣效應(yīng)”）。若用溫箱溫育則ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最后將ELISA板放在濕紗布上。采用這種溫育方式的關(guān)鍵是必須保證濕盒內(nèi)的溫度達(dá)到反應(yīng)的要求，可在反應(yīng)前將濕盒預(yù)溫至規(guī)定的溫度，并用溫度計(jì)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程。采用水浴時(shí)，將ELISA板置于水浴箱中，板底貼著水面。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋或用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。溫育過程中，反應(yīng)板不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腅LISA試劑盒一般都規(guī)定

14、了明確的溫育溫度，若要求室溫溫育，則一般是指2025。微波輻射法能縮短溫育時(shí)間，但不能解決“邊緣效應(yīng)”，因而較少使用。3.洗滌洗滌是ELISA測(cè)定過程中決定實(shí)驗(yàn)成敗的一個(gè)關(guān)鍵步驟。其目的是去除反應(yīng)體系中與反應(yīng)無關(guān)的成分、未結(jié)合的酶結(jié)合物以及反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。由于抗原和抗體的包被通常是在堿性條件下與固相的疏水鍵相互作用而被動(dòng)吸附于其上的，因此必須注意非離子去垢劑的使用濃度，最常用的洗滌液是含0.05吐溫20的0.02mol/L， pH 為7.4的 PBS液，如果洗滌液中的吐溫20超過 0.2，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響實(shí)驗(yàn)的測(cè)定下限。洗滌可采用洗板機(jī)或手工

15、洗滌兩種方式，手工洗板則分為浸泡式和流水沖洗式洗滌。無論洗板方式如何，在向板孔內(nèi)注液時(shí)應(yīng)當(dāng)避免氣泡殘留孔內(nèi)，否則會(huì)因洗滌液難以進(jìn)入孔中而影響洗滌效果。在采用洗板機(jī)洗板時(shí)，一定要將板條平放于板架上，保證洗板機(jī)上的每個(gè)吸液針都能一致地插入板孔底部將洗液完全吸凈，否則空白值將升高甚至出現(xiàn)“花板”現(xiàn)象（背景不干凈），造成實(shí)驗(yàn)失敗，尤其是當(dāng)酶結(jié)合物非特異吸附而殘留于板孔時(shí)。若采用手工洗板，則可在每次棄去板孔內(nèi)液體后將反應(yīng)板于布料上拍干，布料可在消毒洗滌后重復(fù)使用。手工洗板一般為35次，使用洗板機(jī)洗板時(shí)，其所需次數(shù)可通過以下實(shí)驗(yàn)確定：選擇8×12 HBsAg ELISA包被板條，在每孔中平行加入

16、相同的一份弱陽性血清，按試劑盒說明加入酶結(jié)合物并完成溫育，洗板機(jī)設(shè)置如下：第1次洗滌1排、第2次洗滌2排、第3次洗滌3排直至8次洗滌8排，每次只洗滌1遍，其結(jié)果是第1排洗滌了8遍，第2排洗滌7遍第8排洗滌1遍，加底物顯色后，根據(jù)吸光度值不再改變的反應(yīng)條的洗滌次數(shù)來確定最佳的洗板次數(shù)，例如第3排反應(yīng)條吸光度值不再改變，則認(rèn)為該項(xiàng)目最佳洗滌條件為6遍。另外有三方面必須注意：一是在使用洗板機(jī)洗板時(shí)，通常在上機(jī)前應(yīng)先將反應(yīng)液棄去并用流水快速?zèng)_洗1遍，避免因反應(yīng)液對(duì)洗板機(jī)管道污染而造成的交叉污染和背景顏色加深，但對(duì)于粘性大的稀釋液或反應(yīng)液而言，則需直接上機(jī)洗滌，并增加洗板后清水沖洗管路的次數(shù)；二是對(duì)于兩

17、步法而言第一步洗滌次數(shù)不宜太多，否則將降低結(jié)果的吸光度值。4.顯色顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應(yīng)，在以HRP作為標(biāo)記酶的ELISA試劑盒中，主要采用TMB和OPD兩種底物，其中以TMB最為多見，TMB底物顯色一般要求室溫或37反應(yīng)1530分鐘。研究表明，顯色受時(shí)間和溫度的影響，一般37反應(yīng)30分鐘可使顯色充分，如果縮短反應(yīng)時(shí)間或者降低反應(yīng)溫度均可影響檢測(cè)的下限。為了保證結(jié)果的穩(wěn)定性，必須固定顯色時(shí)間和溫度，但不少操作者往往忽略了這一點(diǎn)。TMB顯色體系的A液和B液可在使用前先混合然后用排槍加入反應(yīng)孔中，這樣既節(jié)省人力又縮短了操作時(shí)差對(duì)結(jié)果的影響。反應(yīng)液應(yīng)新鮮配制并且避免接觸金屬器皿，否則

18、可因氧化等原因產(chǎn)生顏色反應(yīng)。OPD由于其具有致癌性目前已很少使用。5.比色ELISA顯色的結(jié)果必須通過酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測(cè)，有兩個(gè)重要的原因：一是不同的個(gè)體的色覺存在差異，如果僅憑肉眼判斷，則結(jié)果重復(fù)性差，并且難以形成統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)，尤其是對(duì)于HBeAb、HBcAb這樣的檢測(cè)項(xiàng)目；二是日益頻繁的醫(yī)療糾紛要求臨床實(shí)驗(yàn)室必須對(duì)ELISA檢測(cè)的原始吸光度值，陰陽性判斷結(jié)果等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行保存，否則面對(duì)醫(yī)療糾紛時(shí)將無法舉證。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止，各類酸性終止液則將藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色。有實(shí)驗(yàn)表明，從終止反應(yīng)后2分鐘開始，樣本的吸光度值逐漸下降，起始吸光度值越

19、高其下降速度越快，為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在終止反應(yīng)后2分鐘內(nèi)讀取吸光度值。酶標(biāo)儀應(yīng)采用雙波長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，必須包括對(duì)顏色產(chǎn)物敏感和不敏感的兩個(gè)吸收峰波長(zhǎng)，在非敏感波長(zhǎng)處測(cè)定特異性顯色的吸光度值接近為零，此時(shí)測(cè)的吸光度值為容器上的劃痕、指印、背景等造成的光干擾。以TMB底物為例，其最大吸收的波長(zhǎng)為450nm，非敏感波長(zhǎng)為630nm，雙波長(zhǎng)檢測(cè)最終得到的吸光度值為兩者之差。雙波長(zhǎng)測(cè)定能去除背景的干擾，一般不設(shè)空白孔，否則會(huì)出現(xiàn)吸光度值為負(fù)值的現(xiàn)象。酶標(biāo)儀的使用需強(qiáng)調(diào)儀器的維護(hù)和保養(yǎng)，酶標(biāo)儀首先應(yīng)放置通風(fēng)處，避免機(jī)器內(nèi)部尤其是濾光片發(fā)霉，在使用過程中避免酸等物質(zhì)溢出腐蝕儀器，每半年或一年請(qǐng)計(jì)量局對(duì)酶

20、標(biāo)儀進(jìn)行檢定，并請(qǐng)廠商定期維護(hù)。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體。酶標(biāo)儀在使用前應(yīng)先預(yù)熱1530分鐘，測(cè)讀結(jié)果會(huì)更穩(wěn)定。五、灰區(qū)的設(shè)置通常情況下，ELISA定性實(shí)驗(yàn)以“陽性”和“陰性”來報(bào)告結(jié)果，兩者間有一條分界線被稱為“陽性判斷值”（cut-off alue，CO值），這是定性免疫測(cè)定結(jié)果報(bào)告的依據(jù)。由于ELISA CO值的設(shè)置不能區(qū)分所有正常和異常的人群，尤其是位于CO值附近的人群，并且ELISA檢測(cè)具有以下幾個(gè)特點(diǎn)：檢測(cè)變異大（18%65%）；不同試劑盒CO值存在差異；病毒感染存在窗口期；病毒變異后表達(dá)產(chǎn)物含量低以及個(gè)體差異等，因此在CO值附近存在一個(gè)臨床意義可疑的的區(qū)域被稱之

21、為“灰區(qū)”，在國(guó)內(nèi)的傳染性病原體抗原和抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒中均未涉及“灰區(qū)”的設(shè)置，但僅僅依靠CO值來決定感染的有無，尤其是對(duì)獻(xiàn)血員的篩查具有較大的風(fēng)險(xiǎn)。因此對(duì)于檢測(cè)結(jié)果位于“灰區(qū)”的病人可采用確認(rèn)實(shí)驗(yàn)或追蹤檢測(cè)的辦法加以確診。目前“灰區(qū)”的設(shè)置有二種方式：CO×（1±C）， C為該試劑的批內(nèi)C (一般在15-20%)；CO±2s，s為實(shí)驗(yàn)室做室內(nèi)質(zhì)控ROC（常規(guī)條件下的變異）的標(biāo)準(zhǔn)差。六、標(biāo)本復(fù)查ELISA手工檢測(cè)過程復(fù)雜，影響因素較多，即使室內(nèi)質(zhì)控在控，也可能因孔間差異而造成結(jié)果的差異，因此加大復(fù)查力度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的可靠方法，比如對(duì)HBsAg、HBe

22、Ag、HC-Ab、HI-Ab、TP-Ab等項(xiàng)目的可疑、弱陽性標(biāo)本及少見模式的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)查。復(fù)查方式主要有兩種：一是采用同一種試劑復(fù)查，理由是市售試劑均通過國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）認(rèn)可，嚴(yán)格按照其說明書操作，檢測(cè)結(jié)果具有法律效應(yīng)，若使用不同的試劑（非確證試驗(yàn)）復(fù)查，當(dāng)結(jié)果不相符合時(shí)，則最終結(jié)果難以判斷（免疫檢測(cè)缺乏“金標(biāo)準(zhǔn)”）。另一種復(fù)查方式是采用國(guó)外進(jìn)口試劑進(jìn)行復(fù)查，其理由是盡管進(jìn)口試劑并不是“金標(biāo)準(zhǔn)”，但實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)此高度重視，并且使用了質(zhì)量較好，價(jià)格較貴的試劑，但該法對(duì)于小醫(yī)院而言則很難實(shí)施。七、結(jié)果判斷和報(bào)告常用下列幾種方法表示結(jié)果：1.定性測(cè)定(1)陽性判定值法(cut-

23、off alue，CO)：一般為陰性對(duì)照的平均A值加一個(gè)常數(shù)，試劑制備、檢測(cè)過程必須嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)化，要先計(jì)算出陽性對(duì)照A值平均數(shù)和陰性對(duì)照A值平均數(shù)。標(biāo)本A值陽性判定值為陽性。陽性判定值公式中的常數(shù)是在特定的檢測(cè)系統(tǒng)中通過對(duì)大量標(biāo)本的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)而得到的。現(xiàn)以HI檢測(cè)試劑盒為例。NC=陰性質(zhì)控對(duì)照的A值；PC1=抗-HI-1陽性質(zhì)控對(duì)照的A值；PC2=抗-HI-2陽性質(zhì)控對(duì)照的A值；NC值的要求：NC必須小于0.250。去掉大于等于0.250的陰性質(zhì)控對(duì)照。計(jì)算留下的陰性質(zhì)控對(duì)照的平均值（NCx）。NC必須在0.6NCx和1.4NCx之間。去掉NC小于0.6NCx和大于1.4NCx的陰性質(zhì)控對(duì)照。實(shí)驗(yàn)

24、滿足下列條件有效：多于半數(shù)的陰性質(zhì)控對(duì)照符合要求（一般為1個(gè)PC，3個(gè)NC）；PC1-NCx0.400；PC2-NCx0.400(如果使用)。如果實(shí)驗(yàn)有效，CO=NCx+0.100,樣品A值大于等于CO，判定為有活性反應(yīng)。樣品A值小于CO，判定為無活性反應(yīng)。根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對(duì)照和陽性對(duì)照也起到了質(zhì)控的作用，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會(huì)產(chǎn)生“實(shí)驗(yàn)無效”的后果。由此可以看出為了避免檢測(cè)結(jié)果受單孔陽性或者陰性對(duì)照的影響（當(dāng)參與CO計(jì)算時(shí)），必須設(shè)立多孔對(duì)照、合理布局，并限定取舍條件。(2)S/C（待測(cè)標(biāo)本A值校準(zhǔn)品A值）：S/C1.1為陽性，S/C0.8為陰性；S/C0.8但1.1為

25、可疑，反應(yīng)體系中陽性、陰性對(duì)照及校準(zhǔn)品檢測(cè)的吸光度必須落在規(guī)定的范圍內(nèi)，結(jié)果才有效。(3)S/N值法(待測(cè)標(biāo)本A值陰性對(duì)照A值)或SCo值法：通常SN21 ，SCo1為陽性。(4)抑制率法：在競(jìng)爭(zhēng)抑制法中結(jié)果可用抑制率表示。抑制率（）（陰性對(duì)照A值-標(biāo)本A值）/陰性對(duì)照A值×100%，一般以抑制率50%為陽性。2.半定量測(cè)定 結(jié)果一般以滴度表示。將標(biāo)本連續(xù)稀釋后，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，在陽性臨界值以上的最高稀釋度即為該標(biāo)本的“滴度”。3.定量測(cè)定 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)品作一系列稀釋后進(jìn)行ELISA測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。在ELISA定量檢測(cè)中每一塊反應(yīng)板都必須繪制相應(yīng)的

26、標(biāo)準(zhǔn)曲線。4.結(jié)果報(bào)告?zhèn)鹘y(tǒng)的ELISA結(jié)果只報(bào)告“陽性”或者“陰性”，但不能解決“灰區(qū)”的問題，因此引入“可疑”的報(bào)告方式是比較合理和科學(xué)的，同時(shí)對(duì)結(jié)果做必要的說明，如“結(jié)果已經(jīng)復(fù)查，建議定期復(fù)查或定量檢測(cè)”；對(duì)于HBeAb、HBcAb檢測(cè)，由于各試劑盒CO值差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，位于CO值附近的標(biāo)本復(fù)查結(jié)果陰陽性只是概率事件，另外HBcAb存在原倍和1：30檢測(cè)模式及定量檢測(cè)模式，報(bào)告結(jié)果的不一致對(duì)于臨床實(shí)驗(yàn)室來說是不可回避，也是目前醫(yī)療糾紛主要集中點(diǎn)和“結(jié)果互認(rèn)”的最大障礙，因此在減小室內(nèi)變異的同時(shí)必須引入陽性和弱陽性的報(bào)告方式。八、原始記錄ELISA檢測(cè)結(jié)果變異大，不同

27、體系難以溯源，因結(jié)果不一致而引起的醫(yī)療糾紛逐日增多，因此ELISA檢測(cè)的原始存根必須完整而全面地保存，包括布局，原始吸光度值，檢測(cè)的陰陽結(jié)果，檢測(cè)者，試劑廠家，批號(hào)，質(zhì)控品來源及批號(hào)等。嚴(yán)禁人為修改檢測(cè)結(jié)果。九、質(zhì)量控制1.室內(nèi)質(zhì)量控制（室內(nèi)質(zhì)控）ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體，與檢出量無關(guān)，因此質(zhì)量控制（quality control, QC）要保證試驗(yàn)的靈敏度和重復(fù)性。目前定性實(shí)驗(yàn)的質(zhì)控規(guī)則還還存在爭(zhēng)議，目前有以下幾種比較流行的理論：室內(nèi)質(zhì)控品室內(nèi)質(zhì)控品的穩(wěn)定以及合適的濃度是運(yùn)用一切質(zhì)控規(guī)則的前提。可選擇S/CO值減去精密度測(cè)定中得到的三倍批間C%（通常的ELISA測(cè)定批間

28、變異（C%）在15%左右）與該S/CO值的乘積（意即三倍SD）仍大于1的質(zhì)控血清作監(jiān)測(cè)重復(fù)性的室內(nèi)質(zhì)控品用。 計(jì)算公式：S/CO（1-3C%）=S/CO-3SD。同時(shí)選擇S/CO處于1.5左右的質(zhì)控血清以判斷每次測(cè)定時(shí)試劑盒測(cè)定下限的有效性。 “即刻性”質(zhì)控一些實(shí)驗(yàn)室不是每天進(jìn)行ELISA項(xiàng)目的檢驗(yàn)，而ELSIA部分試劑盒效期短 ，用同一批號(hào)試劑盒連續(xù)常規(guī)測(cè)20次，難度較大。采用"即刻法"質(zhì)控統(tǒng)計(jì)方法，只需連續(xù)測(cè)3次，即可對(duì)第3次檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控。先將測(cè)定值從小到大排列，X1最小，Xn最大 ；計(jì)算X和s；計(jì)算SI上限值和下限值。SI上=（X最小-X）/S，SI下=（X最大-

29、X）/S；對(duì)照SI表，檢查是否出控。SI上、下限規(guī)定值，在控； SI上或下限>規(guī)定值，失控。Leey-Jennings質(zhì)控圖結(jié)合Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法Leey-Jennings質(zhì)控圖以及Westgard多規(guī)則質(zhì)控方法最早應(yīng)用于生化檢測(cè)的質(zhì)量控制，在ELISA檢測(cè)中仍為探索階段，一般認(rèn)為：一 次超出3SD；連續(xù)二次超出2SD；35次連續(xù)處于一側(cè)的2SD之內(nèi)；57次連續(xù)偏向橫軸的一側(cè)，均為失控。目前多采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”。另外還有Westgard多規(guī)則質(zhì)控規(guī)則、累積和（CUSUM）質(zhì)控規(guī)則等質(zhì)控方法。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心確定的質(zhì)控方法：室內(nèi)質(zhì)控品：定

30、性測(cè)定的室內(nèi)質(zhì)控品，除了試劑盒附帶的陰陽性對(duì)照外，實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該選擇至少2個(gè)室內(nèi)質(zhì)控品，其中一個(gè)為弱陽性質(zhì)控品，接近Cutoff值，S/Co值應(yīng)該為24之間；另一個(gè)為陰性質(zhì)控品。定量測(cè)定則至少要求一個(gè)水平的質(zhì)控品。測(cè)定頻度：每臺(tái)儀器，每次檢測(cè)患者樣本時(shí)至少測(cè)定一次室內(nèi)質(zhì)控品；ELISA測(cè)定每塊板都要測(cè)定室內(nèi)質(zhì)控品。質(zhì)控圖繪制：定性測(cè)定可采用弱陽性質(zhì)控品的S/Co值作質(zhì)控圖。定量測(cè)定參照臨床化學(xué)的繪制方法。質(zhì)控判斷規(guī)則：定性測(cè)定為弱陽性的質(zhì)控品不能測(cè)定為陰性；陰性質(zhì)控品不能測(cè)定為陽性。重復(fù)性的判斷規(guī)則為12S（警告限），13S為失控限。定量測(cè)定參照臨床化學(xué)的判斷規(guī)則。室內(nèi)質(zhì)控的現(xiàn)狀及應(yīng)對(duì)措施免疫質(zhì)

31、控品制作困難，不管是自制血清或者購于其它機(jī)構(gòu)，其穩(wěn)定性和濃度很難達(dá)到要求，加之ELISA影響因素較多，失控后很難找到確切的原因。因此如何開展ELISA室內(nèi)質(zhì)控一直困擾著臨床檢測(cè)者。基于此，不同實(shí)驗(yàn)室采取了不同的應(yīng)對(duì)措施，舉例如下：選擇衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心（NCCL）的低值質(zhì)控血清作為室內(nèi)質(zhì)控品，儲(chǔ)備量以3個(gè)月，采用一次超過2SD作為“告警”，一次超出3SD為“失控”的質(zhì)控規(guī)則，（但該法對(duì)于HBeAb（4NCU/ml）、 HBcAb(2NCU/ml)檢測(cè)不適用，因?yàn)榧词官|(zhì)控在控，其結(jié)果也可能為陰性）；由于質(zhì)控品不穩(wěn)定，每個(gè)月需重新設(shè)立靶值 ，并根據(jù)常規(guī)C設(shè)定SD（SD= ×C¯

32、）；陰陽性對(duì)照正常，室內(nèi)弱陽性和陰性質(zhì)控正常，且沒有出現(xiàn)“花板”（洗板不干凈，背景顏色深）的情況下認(rèn)為該檢測(cè)批有效，但仍需對(duì)位于“灰區(qū)”和弱陽性的HBsAg、HBeAg結(jié)果及少見模式結(jié)果進(jìn)行復(fù)查，避免偶然因素及孔間差對(duì)結(jié)果造成影響；若陰陽性對(duì)照、陰性質(zhì)控異常，或出現(xiàn)“花板”的情況則必須整批復(fù)查；在陰陽性對(duì)照、陰性質(zhì)控正常且未出現(xiàn)“花板”的情況下，弱陽性質(zhì)控S/Co超出-3SD時(shí)復(fù)查位于“灰區(qū)”標(biāo)本，超出+3SD時(shí)則復(fù)查弱陽性標(biāo)本；對(duì)于抗體檢測(cè)，尤其是競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)HBeAb、HbcAb，由于不同試劑盒、不同檢測(cè)方法間CO值存在差異及變異系數(shù)大等因素，結(jié)果缺乏可比性，失控后的處理很難滿意地解決，在沒

33、有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)、較小的變異系數(shù)及明確的臨床意義的情況下，引入弱陽性報(bào)告方式在臨床實(shí)踐中證明可行；室內(nèi)質(zhì)控的評(píng)價(jià)：認(rèn)真分析每一次室內(nèi)質(zhì)控失控的原因，并對(duì)各項(xiàng)檢測(cè)的均值，C等進(jìn)行月與月之間的比較分析，及時(shí)發(fā)現(xiàn)試劑盒檢出能力的變化及操作中存在的問題，并采取適當(dāng)?shù)拇胧﹣硖岣邫z測(cè)的精準(zhǔn)性。2.室間質(zhì)量評(píng)價(jià)（室間質(zhì)評(píng)）室間質(zhì)評(píng)是一種回顧性評(píng)價(jià)，主要是控制實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，也是某些定量實(shí)驗(yàn)量值的溯源。作為臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)積極參與各級(jí)室間質(zhì)評(píng)計(jì)劃，其要點(diǎn)是保證同病人標(biāo)本一樣對(duì)待室間質(zhì)評(píng)物。必須強(qiáng)調(diào)的是室間質(zhì)量評(píng)價(jià)結(jié)果必須同室內(nèi)質(zhì)控一并分析，查找原因以期改進(jìn)工作中的不足，同時(shí)指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇合適的試劑盒。十、免疫

34、檢驗(yàn)存在的問題HB基因組變異對(duì)病毒HBsAg和HBeAg測(cè)定影響問題，以及如何評(píng)價(jià)試劑盒對(duì)這些變異株的檢測(cè)效能；HBcAb檢測(cè)在保證輸血安全中的意義；HBeAb、HBcAb溯源性問題；HBcAb檢測(cè)模式的問題等均困擾著臨床檢測(cè)者。1 李金明. 臨床酶免疫測(cè)定技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：87-105.2 沈霞. 臨床免疫學(xué)與免疫學(xué)檢驗(yàn)新技術(shù). 第1版. 北京：人民軍醫(yī)出版社，2002：12-19.3 陶義訓(xùn).免疫學(xué)和免疫學(xué)檢驗(yàn).第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999：140.4 李金明. 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物測(cè)定及結(jié)果解釋的若干問題. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（5

35、）：385-389.5 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心，中國(guó)醫(yī)院協(xié)會(huì)臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會(huì). 醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法及配套文件，2006：10-11.在定性免疫測(cè)定中，確定合適的陰陽性判斷值對(duì)減少假陽性和假陰性具有重要意義。處于陽性判斷值定值域中的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。目前國(guó)內(nèi)用做傳染性病原體抗原或抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒沒有統(tǒng)一在定性免疫測(cè)定中，確定合適的陰陽性判斷值對(duì)減少假陽性和假陰性具有重要意義。處于陽性判斷值定值域中的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。目前國(guó)內(nèi)用做傳染性病原體抗原或抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒沒有統(tǒng)一的“灰區(qū)”設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)，而僅僅以“陽性判斷

36、值”（Cut off Value，Co值）來判斷陰陽性結(jié)果，這就會(huì)涉及到檢測(cè)結(jié)果低于但接近Co值的血液是否合格的問題。根據(jù)ELISA測(cè)定的Co值來判斷結(jié)果，假陽/陰性不可能完全避免，其只不過是將假陽/陰性降低到較低的比例而已。那么“灰區(qū)”范圍設(shè)置多大才比較合適，我們就此問題進(jìn)行了初步探討，現(xiàn)報(bào)告如下。1 材料與方法 11 樣本 2007年5月9月，本中心初、復(fù)檢抗HCV結(jié)果不一致但復(fù)核結(jié)果為陰性的樣本1 394份。2006年1月2007年9月抗HCV陽性報(bào)廢的血液樣本643份，并特意收集這期間初、復(fù)檢結(jié)果不一致且陰性結(jié)果協(xié)方差值（Cov值）050的樣本44份。1 NCU/ml抗HCV定值血清(

37、批號(hào)0802)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。樣本采集、保存與運(yùn)輸按照“全血及成分血質(zhì)量要求（GB184692001）”中“全血的質(zhì)量要求”收集全血，在血液采集后46 h內(nèi)以1 500 r/min，15 min離心取上清收集血漿并分成3份，分別用于ELISA方法 抗HCV、FQPCR方法HCV RNA檢測(cè)和復(fù)核檢測(cè)。-20下保存期為3個(gè)月、-70下保存期為1年，運(yùn)輸采用干冰。 12 試劑與儀器 酶聯(lián)免疫試劑盒初檢試劑(廈門新創(chuàng)公司)、復(fù)檢試劑（上海科華公司）、病毒核酸擴(kuò)增熒光檢測(cè)試劑盒（達(dá)安基因股份有限公司，批號(hào)：H10762）；（上海浩源生物科技有限公司，批號(hào)：）、復(fù)核試劑測(cè)試系統(tǒng)COBAS公司

38、AmpliScreen HCV Test (V20)，批號(hào)：H10762。核酸擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光基因分析儀（達(dá)安基因股份有限公司，DA7600）、核酸自動(dòng)提取系統(tǒng)（Chemagen公司，Magnetic Separation Module I型）、核酸提取儀（TBG公司，EZ Beads32）、PCR核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（ABI公司，7500實(shí)時(shí)PCR分析系統(tǒng)）、全自動(dòng)樣品處理機(jī)（TECAN公司，RSP200/8型）、全自動(dòng)酶免分析儀（Microlab公司，F(xiàn)AME 24/20型）。 13 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 初復(fù)檢篩查實(shí)驗(yàn)采用ELISA方法，對(duì)初次具反應(yīng)性的樣本用相同試劑再次雙孔復(fù)試，所有陰性樣本再用FQPCR

39、方法檢測(cè)。對(duì)于初、復(fù)檢結(jié)果不一致的樣本用FQPCR方法和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)測(cè)試系統(tǒng)檢測(cè)。各項(xiàng)試驗(yàn)均嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。 14 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 初、復(fù)檢2遍檢測(cè)均陽性的樣本測(cè)試結(jié)果納入陽性樣本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，對(duì)初、復(fù)檢2遍檢測(cè)結(jié)果不一致的，以HCV RNA檢測(cè)結(jié)果和復(fù)核試劑結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，如復(fù)核結(jié)果為陽性，ELISA結(jié)果數(shù)據(jù)均歸入陽性統(tǒng)計(jì)，否則歸入陰性數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。2 結(jié)果 21 常規(guī)檢測(cè)初、復(fù)檢結(jié)果 結(jié)果不一致且陰性結(jié)果Cov值050的樣本44份，以30%作為“灰區(qū)范圍”，處于“灰區(qū)范圍”的樣本共10份，ELISA檢測(cè)結(jié)果見表1。對(duì)這些樣本采用FQPCR方法

40、和COBAS AmpliScreen HCV Test (V20)測(cè)試系統(tǒng)再次檢測(cè)，其中1份HCV RNA陽性樣本，而ELISA抗HCV結(jié)果不確定，Cov值為085135。從而表明篩查試驗(yàn)結(jié)果處于“灰區(qū)范圍”內(nèi)的樣本有可能就是陽性樣本。 由表1結(jié)果可知，處于“灰區(qū)范圍”內(nèi)的樣本共10份，占本項(xiàng)研究全部樣本的049%（10/2037），這些樣本經(jīng)文中方法鑒定后的真陽性和真陰性比例分別為100%（1/10）和900%（9/10）。另外，對(duì)結(jié)果不一致的樣本，分別統(tǒng)計(jì)2種試劑陽性結(jié)果Cov平均值、 s和Cov平均值+2s，計(jì)算值分別為219、069、358；207、084、375。總Cov平均值、s和

41、Cov平均值+2s分別為213、077、367。從而表明結(jié)果不一致的樣本多為Cov值在20左右的弱陽性樣本，一般情況下Cov值40。 22 1394份常規(guī)檢測(cè)初、復(fù)檢抗HCV結(jié)果 結(jié)果不一致而復(fù)試結(jié)果陰性的樣本，Cov值波動(dòng)范圍為000155，按Cov值大小順序排列，以005為組距，統(tǒng)計(jì)各組段的樣本數(shù)量，計(jì)算累計(jì)頻數(shù)和累計(jì)頻率，制作抗HCV陰性樣本Cov值頻數(shù)表，結(jié)果見表2。由表2抗HCV陰性樣本Cov值頻數(shù)表數(shù)據(jù)，計(jì)算百分位數(shù)P25=0117、P50=0179、P75=0268、P95=0761。根據(jù)表2結(jié)果，以各組段樣本數(shù)量為縱坐標(biāo)，以Cov值為橫坐標(biāo)作圖可見陰性樣本Cov值呈偏態(tài)分布，見

42、圖1。 23 抗HCV陽性報(bào)廢的643份血液初、復(fù)檢結(jié)果 統(tǒng)計(jì)結(jié)果：Cov值波動(dòng)范圍在0002200，按Cov值大小順序排列，以050為組距，統(tǒng)計(jì)各組段的樣本數(shù)量，計(jì)算累計(jì)頻數(shù)和累計(jì)頻率，制作抗HCV陰性樣本Cov值頻數(shù)表，結(jié)果見表3。由表3頻數(shù)表數(shù)據(jù)，計(jì)算百分位數(shù)，P5=0588、P25=1628、P50=2780、P75=5163、P95=19488。根據(jù)表3數(shù)據(jù)，以各組段樣本數(shù)量為縱坐標(biāo)，以Cov值為橫坐標(biāo)作圖，可見陽性標(biāo)本Cov值呈偏態(tài)分布，結(jié)果見圖2。表1 抗HCV初、復(fù)檢結(jié)果不一致樣本Cov值 樣本初檢復(fù)檢樣本初檢復(fù)檢樣本初檢復(fù)檢1+（284）-（053）16+（246）-（061

43、）31-（058）+（124）2+（235）-（061）17-（059）+（128）32-（056）+（295）3+（186）-（051）18-（052）+（134）33-（065）+（185）4+（367）-（056）19-（053）+（152）34-（067）+（249）5+（174）-（057）20-（068）+（237）35±（089）+（155）6+（253）-（068）21-（057）+（234）36±（072）+（127）7+（186）-（064）22-（052）+（159）37+（135）±（085）8+（221）-（058）23-（059）+（2

44、55）38±（081）+（254）9+（142）-（052）24-（054）+（104）39±（076）+（266）10+（228）-（059）25-（066）+（132）40±（079）+（224）11+（153）-（057）26-（055）+（301）41±（088）+（492）12+（137）-（058）27-（066）+（184）42+（180）±（073）13+（354）-（055）28-（058）+（198）43+（319）±（078）14+（232）-（066）29-（053）+（162）44+（153）±（0

45、80）15+（203）-（063）30-（068）+（223） 表2 抗HCV陰性樣本Cov值頻數(shù) Covn累計(jì)頻數(shù)累計(jì)頻率(%)Covn累計(jì)頻數(shù)累計(jì)頻率(%)0052472471772085513389598010302549393809051343963401525880757890954134796630202101017729610041351969202581109878771056135797350307611748422110313609756035431217873011551365979204048126590751206137198350451212779161125413

46、75986405010128792321303137898850551413019333135513849928060813099390140213869943065813179448145313899964070613239491150413939993075613299534155113941000080413339562 圖1 抗HCV陰性樣本Cov值頻數(shù) 圖2 抗HCV陽性樣本Cov值頻數(shù) 處在Co定值域中的測(cè)定結(jié)果可歸為可疑，也即ELISA測(cè)定的“灰區(qū)”。由表2、3結(jié)果可知，采用百分位數(shù)法，陰性樣本以單側(cè)95%，陽性樣本以單側(cè)5%計(jì)算，P+5=0588、P-95=0761，故由陰、陽

47、性樣本Cov值計(jì)算的灰區(qū)范圍為05880761。 24 陽性結(jié)果確證 采用衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心1 Ncu/ml定值質(zhì)控血清以及經(jīng)確證結(jié)果呈陽性的12份血清分別用陰性血清稀釋，同時(shí)用2種初篩試劑檢測(cè)，平均值Cov1為陽性，結(jié)果見表4。表3 抗HCV陽性樣本Cov頻數(shù) Covn累計(jì)頻數(shù)累計(jì)頻率(%)Covn累計(jì)頻數(shù)累計(jì)頻率(%)052323358115253483051052751166120253683361567142220812525388367207321533441302540839825692844417135354384453067351545914025458476354739861

48、901455550855440364346750150355386004526460715415545578663501847874341606563875655134917636165356688026064977729170757389116555027807175457789747085107932180115889145753513797818510598930080251580091907605940985451980721956611950290252181032005616958095252381342059625972010025258165210106359876105452

49、98227215363899921103532827422056431000 表4 抗HCV陽性樣本稀釋Cov值 稀釋倍數(shù) 樣本編號(hào)12345678910111213均值1：107068195778638895486954353286364967808556641：206634733386605704564414251743932385387244721：405112791586094902793845840941912254787043841：603862221366043811413784840540901394225393061：803141330983462191113463380310920922084292121：1002191080763111540692472990210450371612391531：1201860880732011090691892270250360270711291121：1401260690612060940560941660110330210361110831：1601010640541850960550541560090210110310550691：1801040680331060650480391490080170170270490561：20007904902