1、第四節第四節 基因差異表達獲得目的基因基因差異表達獲得目的基因差異顯示差異顯示PCRPCR（DDRT-PCRDDRT-PCR）（1）3 錨定引物錨定引物Oligo（dTMN）：）：Oligo（dT）引物的引物的3端加兩個核苷酸（倒端加兩個核苷酸（倒數第二個不再是數第二個不再是T）。）。 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTTM：A、G or C N: A、G、T or C5 3 利用利用mRNA的的poly A尾巴設計尾巴設計 利用利用兩組特殊的引物兩組特殊的引物對差別表達的基因進行擴增對差別表達的基因進行擴增12種錨定引物AG TTTTTTTT5 3 CG T

2、TTTTTTT5 3 GG TTTTTTTT5 3 TG TTTTTTTT5 3 AA TTTTTTTT5 3 CA TTTTTTTT5 3 GA TTTTTTTT5 3 TA TTTTTTTT5 3 AC TTTTTTTT5 3 CC TTTTTTTT5 3 GC TTTTTTTT5 3 TC TTTTTTTT5 3 （2）5端的隨機引物 AAAAAAAAAAAAAAAAmRNA3 5 NM TTTTTTTT5 3 RTNM TTTTTTTT 5 cDNA 3 NNNNNNNNNN5 3 cDNA第二鏈，并第二鏈，并PCR（3）用一種3錨定引物和一種5隨機引物進行擴增12種錨定引物，若與種錨

3、定引物，若與20種隨機引物，可種隨機引物，可組成組成240組引物。組引物。引物組合：引物組合：實驗結果：實驗結果：如果每條帶相當于一種如果每條帶相當于一種mRNA，20000 mRNA基本上反映了一種特定細胞中全部的基本上反映了一種特定細胞中全部的mRNA。在測序膠上，每組擴出在測序膠上，每組擴出50-100條長度為條長度為100-500bp的帶。的帶。240組能分出組能分出20000多條帶！多條帶！（4）隨機-錨定引物PCR的產物電泳比較相同引物對在不同來源相同引物對在不同來源cDNA中的中的PCR產物并排電泳產物并排電泳選擇有差異的帶，回收測序，得到部分選擇有差異的帶，回收測序，得到部分c

4、DNA序列。序列。再通過篩選文庫等各種方法獲得全長再通過篩選文庫等各種方法獲得全長cDNA或基因。或基因。優點：優點：速度快、操作簡單、靈敏度高、樣品需要量速度快、操作簡單、靈敏度高、樣品需要量少等；少等；缺點：缺點：假陽性率高、獲得的假陽性率高、獲得的cDNAcDNA片段很短。片段很短。1976年年H.G. Khorana提出了用化學方法合成基因的提出了用化學方法合成基因的設想，并于設想，并于1979年在年在science上發表了率先成功地上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸合成大腸桿菌酪氨酸tRNA基因的論文。基因的論文。一、化學合成目前常用的方法一、化學合成目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸

5、二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法、固相合成法、自動化合成法。自動化合成法。第五節第五節 基因的化學合成基因的化學合成1、互補延伸連接法二、化學合成二、化學合成DNA片斷的組裝片斷的組裝預先設計的片斷之間有局部互補區，可以相互作預先設計的片斷之間有局部互補區，可以相互作為另一個片斷延長的引物，用為另一個片斷延長的引物，用DNA聚合酶延伸成完聚合酶延伸成完整的雙鏈。整的雙鏈。3 5 5 3 Klenow片段片段引物引物5 3 T4DNA連接酶連接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶（3）T4 DNA連接酶連接酶連接連接T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶完整的完整的DNA雙

6、鏈雙鏈2、互補連接法、互補連接法（合成的（合成的DNA單鏈的單鏈的5端是端是-OH）（2）5端磷酸化端磷酸化（1）互補配對）互補配對預先設計合成的片斷之間都有互預先設計合成的片斷之間都有互補區域，不同片斷之間的互補區補區域，不同片斷之間的互補區域能形成有斷點的完整雙鏈。域能形成有斷點的完整雙鏈。1.全基因化學合成全基因化學合成2. 合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很難操作的含量很低，很難操作cDNA 3. 合成探針序列合成探針序列4. 定點突變合成定點突變合成合成帶有定點突變的基因片斷。合成帶有定點突變的基因片斷。（2）有些基因比較短，化學合成費用較低）有些基因比較短，化學合成費用較低三、三、 化學合成的應用化學合成的應用DNA合成儀5. 合成人工接頭或銜接物合成人工接頭或銜接物含有各種酶切位點的含有各種酶切位點的人工接頭（人工接頭（Adaptor）或或銜接物（銜接物（Linker）序列。序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor本章重