1、第二講第二講 天然藥物研究與開發天然藥物研究與開發一、天然藥物的研究開發程序二、天然藥物中生物活性成分的研究方法三、我國中藥、天然藥物化學研究存在的主要問題。一、天然藥物的研究開發程序一、天然藥物的研究開發程序（一）（一）從天然藥物或中藥中開發新藥的五種從天然藥物或中藥中開發新藥的五種形式形式：經過文獻資料或民間用藥的調研或通過現代藥理學的篩選研究，發現某種動物、植物、礦物或微生物具有藥用價值，然后將其開發成新藥。已知某種成分或某類成分具有藥用價值或已成為新藥，根據動植物的親緣關系，尋找含有這種或這類成分的動植物，進而將其開發成新藥。3. 在不明確有效成分的基礎上，將臨床療效明確的經典方、經驗

2、方或經藥效學研究具有開發價值的復方中藥開發成新藥，或將現有新藥改變劑型。4. 在基本上搞清了有效成分和有效部位的基礎上，將有效部位開發成新藥。5. 通過天然藥物或中藥中的有效成分或生物活性成分的研究，從中發現有藥用價值的活性單體或潛在藥用價值的活性單體即先導化合物先導化合物。什么叫先導化合物呢? 有一定的生物活性，但因其活性不夠顯著或毒副作用較大，無法將其開發成新藥的具有潛在藥用價值的化合物。（二）（二）天然物藥品（一類新藥）的開發研天然物藥品（一類新藥）的開發研究過程究過程：臨床前臨床前臨床臨床試生產試生產活性跟蹤指導下的活性成分(結構新穎和作用機制新穎)的提取分離與結構鑒定將是天然產物化學

3、研究的主要形式。選定研究對象收集資料篩選活性有活性者跟蹤分離得單體或活性部位確認結構動物試驗（藥效、毒性、藥代） 申報臨床研究臨床研究（1、2期） 申請新藥證書及生產批文號試生產（3期） 正式生產。（原料供應保障研究、制劑工業化研究。需1015年時間、 1.52.5億美元）二、天然藥物中生物活性成分的研究方法二、天然藥物中生物活性成分的研究方法（一）天然藥物及中藥中原生生物活性成分（一）天然藥物及中藥中原生生物活性成分的研究的研究:通過調研或廣泛篩選需要開發的天然藥物。根據原料藥中化學成分的性質將其粗分成幾個部分，通過活性測試確定有效部位。1. 在活性測試指導下，采用各種色譜方法和其它方法對活

4、性部位進行跟蹤分離，最終得到活性成分。文文 獻獻 古古 籍、民籍、民 族族 、 民民 間、臨間、臨 床床 名名 方、天方、天 然然 產產 物、國外天然藥物、老藥物、國外天然藥物、老藥活性篩選活性篩選收集樣品收集樣品提取提取粗提物粗提物體外方法體外方法體內方法體內方法有活性有活性無活性無活性分離分離結構鑒定結構鑒定活性跟蹤活性跟蹤有效部位有效部位有效成分有效成分活性先導化合物活性先導化合物結構優化結構優化構效關系研究構效關系研究活性化合物活性化合物新藥研發新藥研發新藥研發新藥研發有效部有效部位新藥位新藥有效成有效成分新藥分新藥新藥研發新藥研發新化學藥新化學藥代謝產物代謝產物體內代謝研究體內代謝研

5、究活性篩選活性篩選活性化合物活性化合物根據理化性質和波譜數據確定單體的化學結構，進行活性評價。對有開發價值的化合物進行結構修飾和構效關系的研究，進而將其按國際慣例開發成創新藥物。 從天然藥物或中藥中開發創新藥物的關鍵是能否從天然藥物或中藥中分離得到有藥用價值藥用價值或潛在藥用價值潛在藥用價值的活活性化合物性化合物； 中藥是創新藥物及其先導化合物的重要來源。 基于高通量活性篩選跟蹤的活性成分研究基于高通量活性篩選跟蹤的活性成分研究細胞、靶酶水平細胞、靶酶水平的高通量篩選的高通量篩選親和色親和色譜技術譜技術生物芯生物芯片技術片技術中藥樣品中藥樣品粗提物粗提物分離部位分離部位單體化合物單體化合物分子

6、烙分子烙印技術印技術（二）天然藥物及中藥中前體活性成分的研究（二）天然藥物及中藥中前體活性成分的研究 有些中藥中的化學成分本身并無生物活性，但經體內代謝后所產生的代謝產物具有很強的生物活性（前體藥物 prodrug）； 例如：秦皮素 3,4-二羥基苯丙酸（抗菌）（體內代謝）體內代謝法： 即將天然藥物或其成分給動物食用后，分別收集動物的糞便、尿、膽汁，然后采用各種提取分離方法分離它們中的代謝產物，并采用譜學和與標準品對照的方法確定它們的化學結構，在化學結構已知的情況下進行生物活性評價，對有開發價值的化合物再進一步開發。（三）血清藥化學和血清藥理學（三）血清藥化學和血清藥理學 除了治療消化道系統或

7、某些特殊的成分，通常天然藥物中成分只有吸收入血吸收入血后才能發揮藥效。 目前進展就較慢，原因如下： 不同化學成分在天然藥物中含量相差巨大（百分之幾至百萬分之幾）； 不同化學成分與血漿蛋白結合率不同； 同一成分在不同時間在血中含量不同（吸收入血成分很快被代謝、分布、排泄）； 天然藥物成分在動物體內難以積累到足量樣品； 結構測定方法有限，多數只能依靠LC-MS。（四）天然藥物的化學修飾或結構改造（四）天然藥物的化學修飾或結構改造 從天然藥物或中藥中篩選追蹤得到活性化合物只是一類創新藥物研究的前期階段。不少天然活性化合物因為存在某些缺陷而難以直接開發利用： 藥效不理想； 存在一定的毒副作用； 含量太

8、低，難以從天然原料中取材； 因結構過于復雜，合成也十分困難； 水溶性差、生物利用度差等等 以它們為先導化合物，在經過一系列的化學修飾或結構改造后，對得到的衍生物進行定量構效關系比較研究，可能發現比較理想的活性化合物，并開發成新藥。 例 青蒿素的構效關系研究 4.4.數據庫檢索數據庫檢索5. 5. 活性化合活性化合物的分離和物的分離和結構鑒定結構鑒定3.3.聯用光譜聯用光譜MSUV2 2. 生物活性測試生物活性測試1. HPLC 分離分離HPLC天然藥物（五）從中藥或天然藥物中跟蹤分離活性化合物一級色譜一級色譜二級色譜二級色譜三級色譜三級色譜高通量篩選高通量篩選LC-MS、LC-NMR色譜高通量

9、篩選快速結構鑒定色譜高通量篩選快速結構鑒定(LC-MS、LC-NMR)聯用技術聯用技術流流份份Planta Med. 67, 411-16 (2001)0102030405060I II III IV V VI VII VIII IX X XICOX-2 Inhibition in Mono Mac 6 cells %Injected: 200 gFor bioassay: 50 gTryptanthrinNNOOIndirubinONHNHOPlanta Med. 68, 64-5 (2002)MeOH Extract of SupernatantColumn ChromatographyH

10、PLCGel ChromatographyCompounds 1 + 2RP low-pressure LC Kieselgel 60 F254; CHCl3-MeOH-H2O (65:35:5)1 Extrakt 2OOHCH3OHOHOHOCH3OHOH1246712467552OHOHCH3OOOOHOHOHCH312445713576OOHCH3OHOHHHHH12467HMBCOOHCH3OHOHOHOCH3OHOH12467471246755OHOHHHOHOOHOHOHOCH3HOHOOHOHOHHHHOCH3HHHOHOHHH13657H3C13467COSYHMBC13567

11、13657H3C 1H-1H 仙鶴草根芽干粉 石油醚提取 殘渣 石油醚提取物 （） 氯仿提取 殘渣 氯仿提取物（） 乙醇提取 殘渣 乙醇提取物（） 鶴草芽中驅絳有效成分agrimonophol的追蹤分離： 仙鶴草根芽是薔薇科植物龍牙草根莖的芽。民間用其干粉內服驅絳蟲，療效顯著。但謂水煎液無效、醇浸后蒸去醇去渣(沉淀)服用也無效，連渣服用有效。研究者選用體外滅囊蟲試驗，按下列程序進行活性追蹤。 結果，石油醚提取物示有明顯體外滅囊活性。TLC檢查示含有十幾種酚性成分。將石油醚提取物隨用不同堿液作pH梯度萃取，由NaHCO3萃取部分分到有效單體鶴草酚，最后經一系列化學降解及光譜測試，確定結構如圖所示

12、，并經化學全合成得到確認。 CH3CH3OOHCH3CH2CH2COOHCH2HOCH3CH3OHCOCHCH2CH3OCH3鶴草酚（Agrimonophol）紫杉醇的發現紫杉醇的發現： 1971年：提取分離，結構確定，活性確認 1975-76年：在多種瘤株上實驗有效； 1977年：臨床前研究； 1979年：作用機理探明； 1982年：期臨床實驗； 1985-86年：期臨床實驗(卵巢癌)； 1986年：紫杉醇側鏈的全合成； 1988年：紫杉醇半合成； 1990-93年：側鏈合成方法的改進； 1992年：FDA批準； 1994年：首次全合成。 紅豆杉莖12kg濃縮物95%乙醇提取氯仿-甲醇萃取水

13、層(棄去) 氯仿30管液滴逆流層析8-18管(14g,T/C=30%,23mg/kg)400管液滴逆流層析170-189管(2.4g,T/C=16%,15mg/kg)析出Taxol(0.5g,T/C=24%,5mg/kg)加苯研磨10974321HOCOCH3OOCOC C C OOHH HNHCOOCH3COOOHOHOHH喜樹堿的發現： 喜樹原料12kg熱正己烷提取正己烷提取物植物殘渣(無活性,棄去)乙醇提取用4倍體積的氯仿+1/4體積的5%含水乙醇處理氯仿層(222g)(高活性)水層氯仿處理氯仿層(32g)水層(高活性)(低活性)NNOOOOHABCDF12310987654141211

14、181920211716茜草根中抗腫瘤活性成分的追蹤分離： 茜草根的抗腫瘤活性系采用S-180荷瘤小鼠進行體內抑瘤試驗篩選過程中發現的。通過活性成分的追蹤分離；最后得到了具有抗腫瘤活性的RA-5及RA-7等環肽類活性物質。 HNOOCH3NOHNNHOROOOOONRA-5 HRA-7 CH3R 分離過程中，活性測試系在接種了p-388白血病瘤細胞的CDFl系小鼠身上進行。每個小鼠接種的瘤細胞數為1106。抑瘤活性以給藥組動物平均存活天數（T）相對于對照組動物平均存活天數（C）的百分率，即延命效果（T/C）表示。T/C125時始認為有活性。 各個分離部分或餾分的活性篩選均按等劑量原則進行。甲醇

15、、苯、乙酸乙酯及水提取物均按200 mg/kg小鼠劑量進行投藥，但從苯提取物出發分離得到的各個組分，以苯提取物數量為100時各個餾分的收率為Y，按200 (Y/100) mg/kg小鼠劑量投藥。故實際上各個組分（子體）的投藥劑量與苯提取物（母體）投藥量相當，測得的活性強弱有定量比較意義。 投藥方法均為腹腔注射，每日1次，從植入腫瘤細胞后次日起連續進行5天。說明：說明：（六）天然藥物中生物活性成分研究需（六）天然藥物中生物活性成分研究需要注意的幾個問題要注意的幾個問題:創新藥物的開發是一個高技術、高風險、高投入、高回報、知識密集型的系統工程, 涉及化學、藥理、制劑、臨床醫學、毒理等多學科領域。（

16、1個創新藥物需 1012年，耗資23億美元；但年銷售額可達百億美元）創新藥物與活性化合物是兩碼事（體內藥效、毒性、臨床療效、制劑、吸收、分布、代謝、排泄、原料、成本、市場）。要注重知識產權的保護（活性部位或活性單體）。 選擇適當的活性測試方法 天然活性化合物的追蹤分離能否取得成功，關鍵在于有無好的生物活性測試體系。試驗模型可以有整體動物、器官、組織、細胞、酶或受體以及體內生物活性物質等。近來并已開始注意在基因調控水平上建立起新的篩選體系。（1）動物模型優點：采用整體動物進行的試驗與人比較相近。缺點：實驗費時費錢，現象復雜，而且動物個體差異以及病理模型難于建立。 用動物模型作為指導分離過程的活性

17、篩選方法不太適宜。 （2）體外模型優點：靈敏、簡便、可用于微量樣品的測試。利用對酶、受體或體內生物活性物質的抑制或促進作用，以及利用基因調控影響進行的活性測試方法簡便易行、可定量。缺點：有時體外活性測試方法所得結果與藥物實際在體內的作用并不平行。 體外活性測試方法在實際工作中得到越來越廣泛的應用。3. 確保供試材料具有活性 這是追蹤分離活性化合物的前提。為了確保活性成分的分離工作在可靠的基礎上進行，對供試天然藥物或中藥有時須采用多項指標、體內外結合進行測試加以確認。 植物粗提物 體外多項指標篩選抗腫瘤活性 示有抗腫瘤活性 體內篩選抗腫瘤活性（P-388荷瘤小鼠） 有抗腫瘤活性 無抗腫瘤活性 確

18、定抗腫瘤活性或作用機制有無新穎性 萃取分離 示有新穎性 萃取物 體外篩選抗腫瘤活性 追蹤分離活性成分 示有抗腫瘤活性 體外復篩抗腫瘤活性 有活性 無活性（棄去） 美國國立癌癥研究中心篩選抗腫瘤活性粗提取物的方法:優點： 活性低或含最少的化合物不至于丟失； 增加了檢出新化合物的機會； 可能分離得到具有不同作用機制的化合物。4、在眾多生物活性中力求找出最本質的作用 天然藥物或中藥在臨床治療上可能作用于多個靶點，因而具有多種療效，即表現出多方面的活性。研究者應當力求找出其中最本質的作用，選擇建立反映臨床治療作用特點、且效果與之平行的活性測試體系，才有可能追蹤分離出目的活性成分或甚至有效成分。供試材料

19、 生理作用 生理活性測定方法 目的活性物質 烏頭 強心、利尿、興奮、鎮痛 離體蛙心 去甲基烏藥堿 大黃 健胃、緩瀉 致瀉活性(小鼠) 番瀉苷 茵陳蒿 利膽、抗炎 膽汁分泌促進作用 茵陳色原酮等 貝(日本產) 口渴、視力減退、瞳孔散大、言語障礙、便秘 小鼠散瞳率試驗 surugatoxin 軟紫草 止血、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌 前列腺素合成抑制活性 arnebinol arnibinone arnebifuranone 5、注意正確比較并判斷各個組分的活性 分離過程中總是按“等劑量不等強度原則”對每一階段得到的組分（子體）進行活性定量評估，并與母體作比較，追蹤活性最強組分。 如果與母體比較，所得幾個子體活性強弱參差不齊，則示活性分離與物質分離平行，預示可能得到良好的分離效果； 如果某個子體活性顯著增強，則示分離過程中可能除去了某種拮抗作用物質。具有良好的物質分離與活性分離。 如果所得各個子體活性均見明顯減弱，則提示活性成分可能分解、流散、或因吸附劑發生不可逆吸附所致，或因該藥物的活性原本為多組分的綜合作用，故分離后反而導致活性的減弱或喪失。 具體問題宜具體分析，在查明原因后立即采取相應對策處理。分離過程中應配合活性測試，采用多種分離手段以求獲得良好的分離效果，并應盡量避免采用可能導致活性成分分解或不可逆吸附的