1、12 細(xì)菌耐受噬菌體的突變是一種自發(fā)突細(xì)菌耐受噬菌體的突變是一種自發(fā)突變，它的發(fā)生與環(huán)境因子無(wú)關(guān)，是隨機(jī)的變，它的發(fā)生與環(huán)境因子無(wú)關(guān)，是隨機(jī)的非定向突變。非定向突變。本組設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)題目： 測(cè)定銅綠假單胞菌耐受噬菌體的突變頻率測(cè)定銅綠假單胞菌耐受噬菌體的突變頻率3實(shí)驗(yàn)選材依據(jù)和背景實(shí)驗(yàn)選材依據(jù)和背景 銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌（P.Aeruginosa） 原稱(chēng)綠膿桿菌。在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見(jiàn)的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。4革蘭染色革蘭染色培養(yǎng)培養(yǎng)綠膿桿菌綠膿桿菌研究背景研究背景 本菌為條件致病菌，是醫(yī)院內(nèi)感染的主

2、要病原菌之一。患代謝性疾病、血液病和惡性腫瘤的患者，及術(shù)后或某些治療后的患者易感本菌。 篩選出優(yōu)良菌種，以便更好地利用其資源進(jìn)行研究并造福人類(lèi)。同時(shí)又對(duì)其外界環(huán)境有更大的適應(yīng)性，更好應(yīng)用于發(fā)展、生產(chǎn)的需要。為獲得其菌群，我們采用利用噬菌體將其敏感細(xì)菌殺死，從而選擇耐受細(xì)菌。 56研究方案：研究方案：為獲得其菌群，我們采用噬菌體將敏為獲得其菌群，我們采用噬菌體將敏感細(xì)菌殺死，將發(fā)生了耐受突變的細(xì)菌選擇出來(lái)，感細(xì)菌殺死，將發(fā)生了耐受突變的細(xì)菌選擇出來(lái)，并繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群。并繁殖成為優(yōu)勢(shì)菌群。研究意義：研究意義：培養(yǎng)出優(yōu)勢(shì)菌群，為以后臨床治療培養(yǎng)出優(yōu)勢(shì)菌群，為以后臨床治療及臨床用藥起輔助性作用。及臨

3、床用藥起輔助性作用。研究目的：研究目的：測(cè)定細(xì)菌自然情況下耐受噬菌體的測(cè)定細(xì)菌自然情況下耐受噬菌體的自發(fā)突變頻率。自發(fā)突變頻率。研究問(wèn)題：研究問(wèn)題：突變率測(cè)定突變率測(cè)定實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)材料 1.毒性噬菌體及其相應(yīng)的敏感宿主菌。毒性噬菌體及其相應(yīng)的敏感宿主菌。 （建議使用人體正常菌群中的細(xì)菌及其噬菌體，如大腸埃希菌或銅綠假單胞菌及其相應(yīng)噬菌體。） 2.LB液體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基及LB固體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基。 3.試管、培養(yǎng)皿、刻度定量吸管。試管、培養(yǎng)皿、刻度定量吸管。 4.酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、普通培養(yǎng)箱等酒精燈、接種環(huán)、顯微鏡、普通培養(yǎng)箱等。7LB是什么？ LB：Luria-Bertani培養(yǎng)基

4、，即溶菌肉湯。8實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟9 1.準(zhǔn)備好銅綠假單胞菌的過(guò)夜培養(yǎng)物和相應(yīng)的噬菌體原液（噬菌體效價(jià)1010）銅綠假單胞菌的銅綠假單胞菌的倒置倒置過(guò)夜過(guò)夜培養(yǎng)物培養(yǎng)物噬噬菌菌體體原原液液實(shí)驗(yàn)步驟 2.將菌液10倍連續(xù)稀釋?zhuān)辽傧♂?管，取0.1ml涂布接種LB瓊脂平板，37度培養(yǎng)過(guò)夜。次日取菌落適宜于菌落計(jì)數(shù)的平板進(jìn)行CFU計(jì)數(shù)，計(jì)算出每毫升菌液中的CHU數(shù)： CFU數(shù)數(shù)=每個(gè)平皿中的每個(gè)平皿中的CFU數(shù)數(shù)10血清稀釋倍數(shù)血清稀釋倍數(shù)10 2.1110倍連續(xù)稀釋?zhuān)辽俦哆B續(xù)稀釋?zhuān)辽?管管CFU是什么？是什么？ CFU (Colony-Forming Units)：菌落形成單位,菌落形成單位。

5、 將稀釋后的一定量的菌液通過(guò)澆注或涂布的方法，讓其內(nèi)的微生物單細(xì)胞一一分散在瓊脂平板上，待培養(yǎng)后，每一活細(xì)胞就形成一個(gè)菌落。與常規(guī)利用顯微鏡對(duì)微生物數(shù)量進(jìn)行測(cè)量不同，主要是對(duì)可見(jiàn)（即多數(shù)情況下形成菌落）的細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行測(cè)量的單位。 單位：CFU/mL。指的是每毫升樣品中含有的細(xì)菌群落總數(shù)，也有用CFU/g即對(duì)應(yīng)固體培養(yǎng)基。12通俗的解釋 是指每毫升菌液中含有多少單細(xì)胞 。傳統(tǒng)上就叫“個(gè)”。但是，我們知道，一個(gè)菌落不一定是一個(gè)細(xì)菌所生成，也可能是由一簇細(xì)菌（一個(gè)細(xì)菌團(tuán)）所生成，這時(shí)候再叫“個(gè)”就不太準(zhǔn)確啦，準(zhǔn)確的叫法就是“菌落形成單位”，英文縮寫(xiě)“CFU”。就像“公斤”和“千克”，只是叫法不同，數(shù)

6、量上沒(méi)有變化。 13實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟3.進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期的大腸埃希菌或銅綠假單胞菌，菌數(shù)約為109CFU/ml左右。 23h后，可見(jiàn)菌液逐步變清，待完全變清（月4h之內(nèi)），將全部菌液均勻涂布到一個(gè)LB瓊脂平板上，置37下培養(yǎng)過(guò)夜。次日計(jì)數(shù)CFU。144.耐受噬菌體突變頻率的計(jì)算 第3步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的耐受菌數(shù)量，第2步中獲得的CFU數(shù)為1ml菌液中的總菌數(shù)。故： 耐受噬菌體突變頻率耐受噬菌體突變頻率 =15第第3步中獲得的步中獲得的CFU數(shù)數(shù)第第2步中獲得的步中獲得的CFU數(shù)數(shù)實(shí)驗(yàn)可行性分析實(shí)驗(yàn)可行性分析1. 標(biāo)本采集方便標(biāo)本采集方便 本菌在自然界分布廣泛，為土壤中存在的最常見(jiàn)

7、的細(xì)菌之一。各種水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等都有本菌存在。本菌存在的重要條件是潮濕的環(huán)境。 采自不同感染部位的標(biāo)本，包括血液、尿液、痰標(biāo)本、膿汁、穿刺液等。還包括來(lái)自醫(yī)院環(huán)境中的各種標(biāo)本如水、空氣、物體表面采樣等。162.分離培養(yǎng)容易本菌生長(zhǎng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高。3. 生長(zhǎng)特點(diǎn)明顯該菌在4不生長(zhǎng)而在42可以生長(zhǎng)。（可用以鑒別）4.采用CFU計(jì)數(shù)的科學(xué)性。5.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象明顯，便于觀察。17預(yù)期結(jié)果預(yù)期結(jié)果18稀釋度稀釋度10-110-110-210-210-710-71 1 2 2 3 3平平均均1 12 2 3 3平平均均1 1 2 2 3 3平平均均CFUCFU數(shù)數(shù)/ /平板平板 每毫升每毫升的的CFUCFU數(shù)數(shù)預(yù)期結(jié)果 經(jīng)相關(guān)文獻(xiàn)預(yù)測(cè)： 銅綠假單胞菌耐噬菌體的突變機(jī)率在1.410-77.910-7之間。19討論討論 上述操作3，通常在4h內(nèi)菌液會(huì)完全變清。 此時(shí)細(xì)菌尚處于生長(zhǎng)曲線的“遲緩期”（即適應(yīng)期），亦即尚未進(jìn)入分裂狀態(tài)。如果少數(shù)事先存在的耐受菌已進(jìn)入分裂期，這是測(cè)定結(jié)果會(huì)被放大，因而失其準(zhǔn)確性。20思考題(1)為什么溶化后的培養(yǎng)基要冷卻至45左右才能倒平板？(2)要使平板菌落計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，需要掌握哪幾個(gè)關(guān)鍵？為什么？(3)試比較平板菌落計(jì)數(shù)法和顯微鏡下直接計(jì)數(shù)法的優(yōu)缺點(diǎn)。21參考文獻(xiàn) 微生物學(xué)通報(bào) MICROBIOLOGY 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)刊號(hào)：ISSN 0253-265