1、DBS22DBS22/018-2012食品安全地方標準 食品中腸球菌的檢測方法2012 年發布2012年實施吉林省衛生廳發布前言本標準根據GB/T1.1-2000標準化工作導則第 1 部分： 標準的結構和編寫規則的要求編寫。本標準分為兩種檢測方法：第1法：腸球菌檢驗 常規培養方法第 2 法：腸球菌檢驗固定酶底物法測定食品中腸球菌的方法。食品衛生微生物學檢驗腸球菌的檢驗因現無國家標準，FDA 、AOAC 、USD 也無標準方法。因此參照了SN/T1933.1-2007 食品和水中腸球菌檢驗方法第一部分：平板計數法和最近似 值測定法和國內雜志公開報道的腸球菌檢驗方法的文獻。該標準應用了Vitek

2、GNI 全自動微生物免疫分析儀）或API 20strep試劑條 1（法國生物梅里埃公司）。增加了固定酶底物法測定食品中腸球菌的方法。本標準的附錄A 、附錄 B 是規范性附錄。本標準負責起草單位：吉林省疾病預防控制中心、長春市疾病預防控制中心。本標準負責起草人: 劉桂華、龔云偉、趙微、李月婷。食品安全地方標準食品中腸球菌的檢測方法1 范圍本標準規定了食品中腸球菌（Enterococcus） 的檢驗方法。本標準適用于各類食品及食源性腸球菌病的檢驗。2 規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單( 不包括勘誤的內容) 或修訂版均不適用于

3、本標準，然而， 鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 4789.1食品衛生微生物學檢驗總則GB/T 4789.28食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑3 設備和材料除微生物實驗室常規滅菌與培養設備外，其他設備與材料如下：3.1冰箱： 0 4 。3.2恒溫培養箱：36 1、 45 1。3.3顯微鏡： 10 100。3.4均質器及無菌均質袋、均質杯或滅菌乳缽。3.5天平： 0 g 500 g ，精確至0.1 g 。3.6 滅菌試管： 18 mm 180 mm、15mm 100 mm及相應的試管架。123.7 滅菌

4、刻度吸管：1 mL、10 mL。3.8 滅菌廣口瓶 : 500mL 。3.9 滅菌培養皿：90 mm 。3.10 酒精燈和接種環。3.11 剪刀、勺子、鑷子。3.12 過濾裝置及濾膜： （ 0.6 m 2.0 m 0.6 m2.5 m）。3.13 全自動細菌生化鑒定儀VITEK ( 生物梅里埃公司) 。4 培養基和試劑4.1 疊氮化鈉葡萄糖肉湯:按附錄第A.1 。4.2 腸球菌肉湯 :按附錄第A.2 。4.3 KF鏈球菌瓊脂 :按附錄第A.3 。4.4 腸球菌瓊脂（膽汁七葉苷疊氮鈉瓊脂）:按附錄第A.4 。4.5 膽汁七葉苷瓊脂（BEA瓊脂） :按附錄第A.5 。4.6 腦心浸液肉湯:按附錄第

5、A.6 。4.7 含 6.5%氯化鈉腦心浸液肉湯:按附錄第A.7 。4.8 腦心浸液瓊脂:按附錄第A.84.9 過氧化氫酶試驗：按附錄第A.9 。4.14Vitek GNI 全自動微生物免疫分析儀）或API 20strep試劑條1（法國生物梅里埃公司1由法國生物梅里埃公司提供的產品的商品名。給出這一信息是為了方便本標本的使用者，并不表示對該產品的認可。如果其他等效產品具有相同的效果，則可使用這些等效的產品。第一法常規培養方法5 檢驗程序腸球菌的檢驗程序如下：6 操作步驟6.1 樣品處理6.1.1 采樣后應盡快進行檢驗，若不能及時檢驗，應放于18 左右保存；非冷凍而易腐的樣品應盡可能及時檢驗。若

6、不能及時檢驗，應冷藏保存的待檢樣品在運送實驗室后應于1 4冰箱保存。樣品采集后8 h 內要完成檢驗。6.2 樣品制備6.2.1 以無菌操作稱取25 g（或 mL)檢樣放入含有225mL滅菌生理鹽水的無菌均質杯或均質 袋或滅菌乳缽中，均質(800 1000r/min)2 min或拍擊式均質器均質2 min 或充分研磨做成1:10 稀釋液。若樣品為液態或粉狀，不需要均質，振蕩混勻即可。-56.2.2 取1: 10 稀釋液 1 mL加到含有 10 mL無菌生理鹽水的稀釋瓶中, 充分混勻制成1 : 100的稀釋液。按上述操作程序進行10倍遞增稀釋直至10 。每個稀釋度換用1支1mL滅菌吸管。6.3 定

7、量檢測6.3.1 平板計數法此方法適用與樣品未經加工處理的生鮮食品及腸球菌菌數大于10CFU/g(mL) 的水和食品。6.3.1.1 接種和培養取 2 個 3 個連續的適宜稀釋度的稀釋液各1mL加入無菌培養皿內, 每個稀釋度做2 個平皿。把融化45 1的腸球菌瓊脂或KF 瓊 脂12mL-15mL傾入培養皿內， 轉動平板充分混合，水平放置， 使瓊脂凝固。 腸球菌瓊脂36224h 培養； KF 平板置36 2 48h 培養。6.3.1.2 菌落形態觀察腸球菌屬細菌在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環的棕黑色菌落；在KF 平板上形成暗紅色至粉紅色菌落，邊緣整齊；用滅菌接種針從每個腸球菌瓊脂平板或KF平板挑

8、取5 個典型菌落。進一步做確證實驗。6.3.1.3 確證實驗典型菌落分別接種到腦心肉湯（ BHIB）和葡萄糖瓊脂斜面或腦心瓊脂（ BHIA）斜面，BHIB 36 2 24h 培養, BHIA36 2 48h 培養。BHIB 肉湯培養 24h 后，每管肉湯培養物分別接種到膽汁七葉苷瓊脂（ BEA）平板、及含6 5% 氯化鈉的 BHIB 肉湯中。 BEA平板及含 6 5% 氯化鈉的 BHIB 肉湯中 36 2 48h 培養，觀察細菌生長情況。 BEA平板上生長并水解七葉苷（形成黑色或棕色沉淀） 65% 氯化鈉的 BHIB 肉湯中 36 2 48h 培養生長良好。具有以上特性的典型菌落可確證為腸球菌

9、。6.3.1.4 菌落計數計數后 , 從每個平板至少選取5 個已計數的菌落進行確證實驗，根據證實試驗確定為腸球菌的菌落數, 按比例計算出該皿內的腸球菌菌落數, 然后計算同一稀釋度兩個平板的平均腸球菌數，再乘其稀釋倍數再乘以10, 即得樣品中CFU/g（ mL）所含腸球菌數并作出報告。-4-4-5例: 將檢樣 10 稀釋液 1mL涂布于 KF瓊脂平板上 , 一塊平板形成的可疑菌落數為 65個, 另一塊平板形成的可疑菌落數為 56個, 各取 5個進行鑒定 , 證實第一塊平板腸球菌的是 4個, 第二塊平板腸球菌的是 5個, 則1g（ mL）樣品中腸球菌數為 (65 4/5) +(56 5/5) 2

10、10 5.410 。6.3.2 最近似值 (MPN)測定法此方法適用于污染程度低的樣品，檢驗含有受損傷的腸球菌的加工食品及腸球菌污染數小于 100CFU/g(mL）的食品。某些不適合用平板計數法的脫水淀粉類食品也可用此法檢驗。6.4.2.1 接種：根據樣品污染情況，選擇能獲得陰性終點的3 個連續稀釋度， 每一稀釋度分別接種三管疊氮化鈉葡萄糖肉湯或腸球菌肉湯(SF 肉湯) 每管接種1ml 樣液( 如接種樣液量為10ml 則應接種于雙料SF 肉湯管中 ) ，混勻后。6.4.2.2 培養：疊氮化鈉葡萄糖肉湯置36 124h 培養，檢查各試管混濁情況；腸球菌肉湯36 1 24h 48 h 培養；肉眼顏

11、色變為黑色的試管，表明有腸球菌生長。6.4.2.3 確證試驗：對所有呈現混濁的疊氮化鈉葡萄糖肉湯或顏色變為黑色的腸球菌肉湯進行確證試驗。用接種環將各管的培養物劃線接種于腸球菌瓊脂平板或KF瓊脂平板，置36培養 24 h 48 h 。腸球菌瓊脂平板36 1 24h培養； KF瓊脂平板 36 1 48 h 培養。對采用普通生化難以鑒定的可疑菌株, 可以采用 API試劑條或 VITEK鑒定。6.4.2.4 腸球菌屬細菌在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環的棕黑色菌落；在KF 平板上形成暗紅色至粉紅色菌落，邊緣整齊。用滅菌接種針從每個腸球菌瓊脂平板或KF 平板挑取5 個典型菌落。按6.3.1.3所述做進一步

12、做確證實驗。6.4.2.5 如一管培養物中所挑取的典型菌落中，有一個確認為腸球菌，則該管應視為陽性。6.4.2.6 根據接種的樣品量和確證為腸球菌的陽性反應管數，查MPN值表（參見附錄B）得出樣品中腸球菌最近似值。6.4.2.7 結果報告腸球菌 MPN/g(mL)。6.5.3 濾膜法：6.4.3.1 傾注融化的4mL-5mL的腸球菌瓊脂或KF 瓊脂于平板上，若平板表面有氣泡，可用火焰灼除。6.4.3.2 根據樣品的污染程度，使用樣液的量為100，10，1.0，0.1或0.01mL 。使用滅菌濾膜過濾樣液，以能在濾膜上生長出20個 -100個菌落為宜。6.4.3.3 將濾過樣液的濾膜緊貼在腸球菌

13、瓊脂或KF瓊脂培養基表面上，避免出現氣泡。 倒置平板于 36培養 48h。6.4.3.4 腸球菌屬細菌在腸球菌瓊脂平板上形成帶棕色環的棕黑色菌落；在 KF 平板濾膜上形成暗紅色至粉紅色菌落。將典型菌落接種于腦心浸液斜面上，36培養 48h。用其培養物做過氧化氫試驗，過氧化氫濃度為 3%，陽性反應者為非腸球菌細菌。將陰性反應者接種于腦心浸液肉湯，置45.培養 48h；同樣方式接種一管膽鹽肉湯，置36培養 3d。在上述兩種情況下生長者為腸球菌。選擇生長20 個-100 個菌落的濾膜，根據所使用的樣品量，計算出樣品 /g（ mL ）中的腸球菌菌數。7 結果計算：7.1 典型菌落計數和確認7.1.1

14、選擇有典型腸球菌菌落的平板，且同一稀釋度3 個平板所有菌落數合計在20 CFU 200 CFU之間的平板，計數典型菌落數。如果：a） 只有一個稀釋度的平板菌落數在20 CFU 200 CFU 之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；b） 所有稀釋度的平板菌落數均小于20 CFU 且有典型菌落，應計數最低稀釋度平板上的典型菌落；c） 某一稀釋度的平板菌落數大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；d） 若所有稀釋度的平板菌落數大于200 CFU且有典型菌落， 應計數最高稀釋度平板上的典型菌落；e） 若所有稀釋度的平板菌落數均不在20

15、CFU 200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于 200CFU時，應計數最接近20 CFU或 200 CFU 的稀釋度平板上的典型菌落。以上按公式（1）計算。f） 若 2 個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU 200 CFU之間，按公式（2）計算7.1.2 從典型菌落中至少挑取5 個典型菌落（小于5 個全選），劃線接種于營養瓊脂平板做純培養， 30 1 培養 24 h 2 h。7.2 結果計數公式（ 1）： T =AC（ 1）Cd式中：T 樣品中腸球菌菌落數；A 某一稀釋度腸球菌典型菌落的總數； B 鑒定結果為腸球菌的菌落數； C 用于腸球菌鑒定的菌落數；d 稀釋因

16、子。A1B1TC1A2B2C 21.1d公式（ 2）：（ 2） 式中：T 樣品中蠟樣芽胞桿菌菌落數；A1 第一稀釋度（低稀釋倍數）腸球菌典型菌落的總數； A2 第二稀釋度（高稀釋倍數）腸球菌典型菌落的總數； B1 第一稀釋度（低稀釋倍數）鑒定結果為腸球菌的菌落數； B2 第二稀釋度（高稀釋倍數）鑒定結果為腸球菌的菌落數； C1 第一稀釋度（低稀釋倍數）用于腸球菌鑒定的菌落數； C2 第二稀釋度（高稀釋倍數）用于腸球菌鑒定的菌落數；1.1 計算系數（如果第二稀釋度腸球菌鑒定結果為0，計算系數采用1）； d 稀釋因子（第一稀釋度）。8 結果與報告8.1 根據 MYP 平板上腸球菌的典型菌落數，按7

17、 中公式計算，報告每g（mL ）樣品中腸球菌菌數，以CFU/g(mL) 表示；如T 值為 0，則以小于1 乘以最低稀釋倍數報告。8.2 必要時報告腸球菌生化分型結果。第二法固定酶底物法測定食品中腸球菌的方法1 原理腸球菌固定底物技術酶底物法（DefinedSubstrateTechnology,DST ）是指在選擇性培養基上能產生?- 葡萄糖苷酶（?-glucosidase）的革蘭氏陽性菌， 該菌群能分解熒光底物?-D-配糖物 (? -D-glucoside)釋放出熒光產物4- 甲基 - 傘形酮（ 4-methyl-umbelliferone），使菌落能夠在紫外光下產生特征性熒光；以此技術來檢

18、測腸球菌的方法為腸球菌酶底物法。此方法避免了傳統培養基中的疊氮化鈉（NaN3）的污染。2 設備和材料2.1 冰 箱 ： 0 42.2 恒溫培養箱：41C（ 0.5 C）2.3 均質器或滅菌乳缽2.4 架盤藥物天平：0g 500g，精確至0.5g 。2.5 滅菌吸管10mL2.6 6 瓦 366nm的紫外燈2.7 滅菌錐形瓶：200mL2.8 無菌移液管：1 mL， 5 mL3 培養基和試劑3.1 Enterolert培養基3.2 純水4 檢驗程序腸球菌檢驗程序見圖1圖 15 操作步驟5.1 以無菌水將樣品 25g（ mL）放于含有 225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當

19、數量的玻璃珠） 或滅菌乳缽內， 經充分振蕩或研磨做成 1：10 的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質機，以 8000r/min 10000r/min 的速度處理 1min，做成 1： 10 的均勻稀釋液。5.2 打開一個 Enterolert 試劑，將其倒入一個無菌瓶中，加入 50ml 純水5.3 移取上述混合液 5ml，加入到 10 個無菌試管中。5.4 加入 1ml 步驟 5.1 中處理后的 1： 10 的樣品到上述 10 個試管中。5.5 在上述每個試管中加入4ml 純水，混勻。放入培養箱在410.5 C培養 24h 28 h 。5.6 24h 后讀結果 , 如果樣品培養超過28h，若未產生

20、熒光，則結果有效；如果產生熒光，則結果是無效的，需要重新檢測。5.7 在一個暗室中，使用6 瓦 366nm的紫外燈對樣品進行觀察。5.8 根據顯熒光的管數，對照MPN（見表1）表得出每1ml 樣品的腸球菌值。注意結果要乘以 100，因為要報告每100ml（ g）腸球菌的MPN值。表 1 腸球菌最可能數（MPN）檢索表100ml最低最高023.013.5無限大總則1.1為了加強公司的環境衛生管理，創造一個整潔、文明、溫馨的購物、辦公環境，根據公共場所衛生管理條例的要求，特制定本制度。1.2集團公司的衛生管理部門設在企管部，并負責將集團公司的衛生區域詳細劃分到各部室，各分公司所轄區域衛生由分公司客

21、服部負責劃分，確保無遺漏。2衛生標準2.1室內衛生標準2.1.1地面、墻面：無灰塵、無紙屑、無痰跡、無泡泡糖等粘合物、無積水，墻角無灰吊、無蜘蛛網。2.1.2門、窗、玻璃、鏡子、柱子、電梯、樓梯、燈具等，做到明亮、無灰塵、無污跡、無粘合物，特別是玻璃，要求兩面明亮。2.1.3柜臺、貨架：清潔干凈，貨架、柜臺底層及周圍無亂堆亂放現象、無灰塵、無粘合物，貨架頂部、背部和底部干凈，不存放雜物和私人物品。2.1.4購物車（筐）、直接接觸食品的售貨工具（包括刀、叉等） ：做到內外潔凈，無污垢和粘合物等。購物車（筐）要求每天營業前簡單清理，周五全面清理消毒；售貨工具要求每天消毒，并做好記錄。2.1.5商品及包裝：商品及外包裝清潔無灰塵（外包裝破損的或破舊的不得陳列）。2.1.6收款臺、服務臺、辦公櫥、存包柜：保持清潔、無灰塵，臺面和側面無灰塵、無