1、 四種常見(jiàn)流式實(shí)驗(yàn)講解四種常見(jiàn)流式實(shí)驗(yàn)講解林奕婷林奕婷2013年年8月月14日日v 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析v DNA含量檢測(cè)與細(xì)胞周期分析v 胞內(nèi)活性氧水平的檢測(cè)與分析v 細(xì)胞表面分子的檢測(cè)與分析v 組合實(shí)驗(yàn)1.1 開(kāi)機(jī)-清洗（原則：先開(kāi)儀器后開(kāi)軟件，開(kāi)機(jī)必清洗）1.2 采集樣本1.3 分析1.4 關(guān)機(jī)（原則：先關(guān)軟件后關(guān)儀器，關(guān)機(jī)前必清洗）1.5 日常維護(hù)1.1 清洗清洗1.2 樣本采集樣本采集edit WL 1.3 分析 見(jiàn)具體實(shí)驗(yàn)的分析。 1.4 關(guān)機(jī)1.5 日常維護(hù)日常維護(hù) 保持空氣干燥，會(huì)使激光器的使用壽命長(zhǎng)一些。 桌面不要有震動(dòng)，以免光路發(fā)生偏移。 上機(jī)前檢查廢液瓶是否已滿，若已滿或

2、將滿請(qǐng)倒掉，用超純水沖洗兩遍，放回原位；洗滌液瓶若已空或?qū)⒖照?qǐng)補(bǔ)滿（ICF：ddH2O=1：4）。 實(shí)驗(yàn)臺(tái)面保持整潔，廢物缸請(qǐng)及時(shí)倒掉。自己的東西實(shí)驗(yàn)后請(qǐng)收走，流式專用的物品請(qǐng)不要帶走。 做完請(qǐng)記得登記。 每周在周一進(jìn)行一次easycheck。 （自己在做實(shí)驗(yàn)之前也可進(jìn)行easycheck，流程見(jiàn)下面。）微珠：10L（用前震蕩混勻）Buffer：190L2.1 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)與分析2.1.1 PI單染法2.1.2 Annexin-PI雙染法2.1.3 線粒體膜電位法凋亡啟動(dòng)凋亡啟動(dòng)凋亡早期凋亡早期凋亡晚期凋亡晚期2.1.1 PI單染法單染法 正常細(xì)胞DNA含量：2n4n 凋亡細(xì)胞：核內(nèi)DNA斷

3、裂，乙醇固定后膜通透性增加，小片段DNA穿膜丟失，胞內(nèi)DNA含量減少。PI染色后，熒光強(qiáng)度減小而形成一個(gè)DNA含量小于2n的分布區(qū)（亞G1峰）。基本原理：基本原理：操作方法與結(jié)果分析見(jiàn)細(xì)胞周期部分。操作方法與結(jié)果分析見(jiàn)細(xì)胞周期部分。優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便，快捷，價(jià)廉，應(yīng)用普遍。缺點(diǎn)：2.1.2 Annexin-PI雙染法雙染法基本原理：基本原理：磷脂酰絲氨酸（PS）能與連接素（Annexin）發(fā)生特異結(jié)合；PI是核酸熒光染料，不能透過(guò)正常細(xì)胞膜，只能進(jìn)入已經(jīng)破損的細(xì)胞膜。正常細(xì)胞：膜完整，PS不外翻PI-/Annexin-凋亡早期：膜完整，PS翻轉(zhuǎn)PI-/Annexin+凋亡晚期：PS外翻

4、，膜通透性增加PI+/Annexin+壞死細(xì)胞：膜嚴(yán)重破損，PS不外翻PI+/Annexin+ 幾乎不存在膜結(jié)構(gòu)PI+/Annexin-結(jié)果分析結(jié)果分析陰性對(duì)照PIPI/Annexin-FITCAnnexin-FITC熒光交疊熒光交疊熒光補(bǔ)償原理熒光補(bǔ)償原理熒光補(bǔ)償熒光補(bǔ)償Annexin-FITC單染優(yōu)缺點(diǎn)：優(yōu)缺點(diǎn)：2.1.3 線粒體膜電位法線粒體膜電位法基本原理：基本原理：-+488nm590nm正常細(xì)胞正常細(xì)胞線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件。JC-1：親脂性陽(yáng)離子熒光染料，特異性地與線粒體內(nèi)膜結(jié)合，膜電位高時(shí)呈聚合體，膜電位低時(shí)呈單體。凋亡細(xì)胞凋亡細(xì)胞-+488nm529n

5、m結(jié)果分析結(jié)果分析用488nm激發(fā)，黃光和綠光通道收集熒光信號(hào)，調(diào)補(bǔ)償糾正綠色熒光（單體）和黃色熒光（聚合物）的重疊部分。線粒體膜電位采用比例法，即根據(jù)綠色熒光與黃色熒光陽(yáng)性百分率之比。 Ratio=G.M./Y.M. 比值升高，膜電位降低，膜受損。 2.2.1 DNA倍體分析PI染色法2.2.2 S期特異性檢測(cè)2.2.3 M期特異性檢測(cè)2.2.1 DNA倍體分析倍體分析PI染色法染色法細(xì)胞周期與DNA含量變化極其FCM分析直方圖基本原理：基本原理：結(jié)果分析結(jié)果分析 Guava原軟件分析Red-ARed-WRed-WRed-AH A W在用第三方軟件分析之前，請(qǐng)將流式結(jié)果按如下所示導(dǎo)出。結(jié)果分

6、析結(jié)果分析 Modfit軟件分析結(jié)果分析結(jié)果分析 Modfit軟件分析圖片拷貝：直接Ctrl+C結(jié)果分析結(jié)果分析 Flowjo軟件分析2.2.2 S期特異性檢測(cè)期特異性檢測(cè)S期DNA合成期，S期的比例增多往往與細(xì)胞分裂的活躍程度相關(guān)。傳統(tǒng)的PI染色可以通過(guò)DNA的倍增區(qū)分G1期與G2/M期。S期則因界限不明顯，難以區(qū)分。若需要準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)S期的變化，需要加入S期的特異性標(biāo)志，即BrdU。BrdU只在DNA合成時(shí)被摻入核酸，是指示DNA復(fù)制的金標(biāo)準(zhǔn)。因此可通過(guò)BrdU-Alex Fluor 488與PI復(fù)染將S期準(zhǔn)確的區(qū)分開(kāi)來(lái)。2.2.3 M期特異性檢測(cè)期特異性檢測(cè)G2期是指DNA合成后期，M期是

7、細(xì)胞分裂期。二者在細(xì)胞周期事件中所處的時(shí)項(xiàng)不同，所表示的生物學(xué)意義也大不相同。準(zhǔn)確檢測(cè)M期的變化對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡及癌癥的研究相當(dāng)重要。M期的檢測(cè)標(biāo)志是絲氨酸磷酸化組蛋白H3(pH3)。當(dāng)細(xì)胞周期從G2期轉(zhuǎn)換到M期時(shí)，染色質(zhì)上的組蛋白H3Ser10發(fā)生磷酸化，并在有絲分裂后快速的去磷酸化。由此組蛋白H3的絲氨酸磷酸化變化將停留在G2期的細(xì)胞與M期的分裂細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)。DCFH-DA單染法DCFH-DADCFHROSDCFDCFH-DA進(jìn)入細(xì)胞在細(xì)胞內(nèi)酯酶作用下脫去二脂形成不發(fā)熒光的DCFH，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)存在H2O2，O2-，OH-等ROS時(shí)被氧化成發(fā)綠色熒光的DCF。注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：（1）陰性細(xì)胞

8、群（峰）和陽(yáng)性細(xì)胞群（峰）分群明顯）陰性細(xì)胞群（峰）和陽(yáng)性細(xì)胞群（峰）分群明顯結(jié)果分析結(jié)果分析 數(shù)據(jù)分析中幾種常見(jiàn)圖形及分析原則分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)；允許陰性對(duì)照非特異性熒光信號(hào)（假陽(yáng)性率）一般小于1%5%；可記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率或平均熒光強(qiáng)度。（2）樣本管與陰性對(duì)照管峰形重疊）樣本管與陰性對(duì)照管峰形重疊樣本管峰形左側(cè)右移，右側(cè)有肩峰，弱陽(yáng)性的樣本常出現(xiàn)此類圖形。分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)應(yīng)設(shè)在兩曲線分離處；可記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率（近似值）或平均熒光強(qiáng)度或弱陽(yáng)性；允許陰性對(duì)照非特異性熒光信號(hào)（假陽(yáng)性率）高些，但陽(yáng)性細(xì)胞百分率（近似值）應(yīng)減去

9、假陽(yáng)性率。樣本管峰形整體右移。在排除非特異性染色的情況下（如設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照、調(diào)節(jié)抗體濃度等），方能進(jìn)行分析。分析原則：分析原則：不可根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)；可記錄平均熒光強(qiáng)度，不可記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率。（3）同時(shí)出現(xiàn)弱陽(yáng)性峰與強(qiáng)陽(yáng)性峰的組合圖形）同時(shí)出現(xiàn)弱陽(yáng)性峰與強(qiáng)陽(yáng)性峰的組合圖形分析原則：分析原則：根據(jù)陰性對(duì)照界定陰性置信區(qū)，陰性置信區(qū)可設(shè)在兩曲線分離處。陽(yáng)性細(xì)胞既含弱陽(yáng)性細(xì)胞又含強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞，但陽(yáng)性細(xì)胞百分率應(yīng)減去假陽(yáng)性率；界定先可設(shè)在弱陽(yáng)性返回基線處，陽(yáng)性細(xì)胞僅表示強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞；可記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率或平均熒光強(qiáng)度。2.4.1 免疫學(xué)檢測(cè)2.4.2 干細(xì)胞分析2.4.1 免疫學(xué)檢測(cè)免疫學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析2.4.2 腫瘤干細(xì)胞分析腫瘤干細(xì)胞分析MCF-7 negative controlMCF-7 CD24MCF-7 CD44MCF-7 CD24/CD440.08%0.03%89.