1、革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)研究進(jìn)展摘要：群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），又稱為自體誘導(dǎo)(autoinduction)，是一種調(diào)節(jié)細(xì)菌群居行為及特殊基因表達(dá)的有效機(jī)制，描述細(xì)菌之間保持細(xì)胞密度變化的化學(xué)信號，是一種細(xì)菌與細(xì)菌間的通訊系統(tǒng)。通常將群體感應(yīng)系統(tǒng)分為革蘭氏革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)、革蘭氏陽性菌的寡肽類群體感應(yīng)系統(tǒng)和感知種間信號的群體感應(yīng)系統(tǒng)。植物病原細(xì)菌中常見的致病菌是革蘭氏陰性菌，所以對革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究很有必要。關(guān)鍵詞：群體感應(yīng) ；革蘭氏陰性； LuxI/LuxR群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），又稱為自體誘導(dǎo)(autoin

2、duction)，是一種調(diào)節(jié)細(xì)菌群居行為及特殊基因表達(dá)的有效機(jī)制，描述細(xì)菌之間保持細(xì)胞密度變化的化學(xué)信號，是一種細(xì)菌與細(xì)菌間的通訊系統(tǒng)。這種通訊系統(tǒng)依賴于一種小的可擴(kuò)散的信號分子，這種小的信號分子稱為自體誘導(dǎo)素(autonicers,AI)，由細(xì)菌產(chǎn)生并向細(xì)胞外擴(kuò)散，在周圍環(huán)境中積累。隨著種群密度的增加，環(huán)境中積累的AI信號分子的濃度也成比例地增高，當(dāng)達(dá)到一定閾值水平時細(xì)菌通過細(xì)胞內(nèi)受體對這些信號分子進(jìn)行檢測，進(jìn)而子與一種轉(zhuǎn)錄激活因子結(jié)合，誘導(dǎo)有關(guān)基因的協(xié)調(diào)表達(dá)1。自體誘導(dǎo)物與轉(zhuǎn)錄活性蛋白相互作用，啟動基因表達(dá)，調(diào)節(jié)相關(guān)群落活動和獨立過程。目前已經(jīng)在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了129個與群體感應(yīng)相關(guān)的基因，包

3、括群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因和信號合成基因。通常將群體感應(yīng)系統(tǒng)分為革蘭氏革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)、革蘭氏陽性菌的寡肽類群體感應(yīng)系統(tǒng)和感知種間信號的群體感應(yīng)系統(tǒng)。植物病原細(xì)菌中常見的致病菌是革蘭氏陰性菌，所以對革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究很有必要。在革蘭氏陰性細(xì)菌中存在自身常見的LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)和感知種間信號的AI-2信號系統(tǒng)。1 革蘭氏陰性菌的LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)革蘭氏陰性菌中感知種內(nèi)數(shù)量的QS系統(tǒng)一般利用酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserinelactones,簡稱 acyl-HSL或AHLs，這類分子一般稱為AI-1。LuxI蛋白是白體誘導(dǎo)物合成酶

4、，能夠合成此類信號分子, LuxR蛋白是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)白體誘導(dǎo)物感受因子，同時也是一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活元件，AHLs擴(kuò)散到細(xì)胞外后2，隨著細(xì)胞密度的增加而積累，當(dāng)這種信號密度積累到臨界密度時就與LuxR結(jié)合，結(jié)合后的復(fù)合物能激活熒光素酶基因轉(zhuǎn)錄。上世紀(jì)70年代，人們在對海洋生物費氏弧菌（Vibrio fischer）發(fā)光機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞間存在信息交流，此后進(jìn)一步證明細(xì)菌細(xì)胞間的信息交流普遍存在于各種細(xì)菌中3,細(xì)菌可以通過分泌特定的信號分子以一種群體密度依賴的方式協(xié)調(diào)自身行動。目前對V.fischer 的生物發(fā)光機(jī)制4已經(jīng)研究的非常詳細(xì)，并成為研究革蘭氏陰性菌群體感應(yīng)的模式系統(tǒng)。目前已在近70

5、個種的革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)了這類LuxI/LuxR型QS系統(tǒng)5，這些信號系統(tǒng)的信號分子與費氏弧菌群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子相似，其系統(tǒng)作用模式如下。如圖1所示,費氏弧菌中的熒光素酶有LuxCDABE基因編碼,LuxI及LuxR蛋白構(gòu)成群體感應(yīng)的調(diào)控蛋白,其中LuxI為群體感應(yīng)信號分子合成酶,能合成一種酰基高絲氨酸內(nèi)酯類化合物N-(3-氧代-己酰)-高絲氨酸內(nèi)酯6,7。LuxR 與群體感應(yīng)信號分子結(jié)合后被激活，對LuxCDABE 基因表達(dá)起正調(diào)節(jié)作用。在低細(xì)胞密度時，細(xì)胞通過LuxI基因產(chǎn)生低濃度的群體感應(yīng)信號分子，LuxCDABE 基因在LuxI 基因下游，此時只能在低水平上進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。群體感應(yīng)信號分子

6、能夠自由通過細(xì)胞膜，從而使胞內(nèi)外群體感應(yīng)信號分子濃度相同。隨著細(xì)胞生長，細(xì)胞密度增加，群體感應(yīng)信號分子積累到極限濃度（110g/mL）時，就能和細(xì)胞質(zhì)中的LuxR蛋白充分結(jié)合，結(jié)合群體感應(yīng)信號分子后，LuxR蛋白的DNA結(jié)合區(qū)域暴露，此時LuxR蛋白能與LuxCDABE 基因的啟動子結(jié)合，從而激活該基因的轉(zhuǎn)錄8。群體感應(yīng)信號分子與LuxR蛋白結(jié)合導(dǎo)致群體感應(yīng)信號分子合成酶及熒光釋放強(qiáng)度呈指數(shù)增加。 細(xì)菌中還必須存在一種組織LuxI/LuxR型群體感應(yīng)過早作用的機(jī)制，因為信號分子和感受因子都是在細(xì)胞質(zhì)中合成并相互作用的。在植物病原細(xì)菌Agrobacterium tumefaciens 中，Lux

7、R的類似物TraR,在沒有AHL存在的情況下，半衰期為幾分鐘，而在AHL存在的情況下，半衰期延長至30min9。TraR的結(jié)構(gòu)決定其與AHL的結(jié)合需要新生多肽折疊10。用放射性同位素標(biāo)記TraR證明，當(dāng)TraR與AHL分子結(jié)合后才能更穩(wěn)定11。acyl-HSL信號是quorum-sensing調(diào)控系統(tǒng)的重要組分，acyl-HSLs的濃度是幾個病原細(xì)菌中決定毒力基因表達(dá)的關(guān)鍵因素，控制或消除病原細(xì)菌quorum-sensing系統(tǒng)中的信號分子acyl-HSLs對病害防治有利。不同的細(xì)菌產(chǎn)生不同的AHL，其變化在于酰基鏈的長度和酰基鏈上的取代基的有無，但是不同的AHL卻有一個共同的高絲氨酸內(nèi)酯結(jié)構(gòu)

8、。據(jù)報道,通過acyl-HSLs的生物降解作用干擾環(huán)境中病原微生物的quorum-sensing系統(tǒng)。在土壤中發(fā)現(xiàn)芽苞桿菌(Bacillus sp.)、爭論貪噬菌(Variovoraxparadoxus)、根癌農(nóng)桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)、青枯菌 (Ralstonia sp.)中能夠產(chǎn)生AHL信號分子降解酶，芽胞桿菌產(chǎn)生的AiiA蛋白已被轉(zhuǎn)入植物中，對歐氏桿菌具有較好抗病性12。2000年，新加坡的Dong等從Bacillus 240B1菌株中克隆到了世界上第一個AHL內(nèi)酯酶基因aiiA,該酶通過水解AHL的內(nèi)酯鍵來鈍化AHL的活性。當(dāng)植物中表達(dá)AHL內(nèi)酯酶時

9、，能夠猝滅病原細(xì)菌群體感應(yīng)的信號傳導(dǎo)，從而增強(qiáng)了植物對病菌的抗性13-15。2003年，Lin等從勞爾氏屬細(xì)菌（Ralstonia）XJ12B菌株中克隆到了一個酰基轉(zhuǎn)移酶基因aiiD，該酶通過水解AHL的酰胺鍵，鈍化AHL信號分子活性16。植物青枯菌（Ralstonia solanacearum）是勞爾氏屬中重要的植物病原細(xì)菌，已測序的GMI 1000菌株acc基因編碼的蛋白序列與AiiD蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)到86%。故推測青枯菌的AAC蛋白可能也具有降解AHL的活性。另外一種信號降解酶為AiiA蛋白。近年來，研究發(fā)現(xiàn)蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus cereus，Bc）可以通過釋放酰基高絲

10、氨酸內(nèi)酯酶（AHL-lactonase，AiiA）來降解AHLs信號分子，降低致病菌的危害程度。且許多編碼AiiA蛋白的基因aiiA已被克隆測序17-19。不同的AiiA所能降解的AHLs種類可能不同。2008年，陳濤等在哈密瓜細(xì)菌性果斑病群體感應(yīng)系統(tǒng)信號分子的檢測及其合成基因LuxI的功能中陳述了哈密瓜果斑病病菌菌株中存在群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)化信號分子降解基因aiiA，降解產(chǎn)生的信號分子，破壞其群體感應(yīng)系統(tǒng)，雖然TLC板分析中，AHL沒有完全被降解，但其生物活性明顯降低，從而證明了群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)與致病性的關(guān)系20。 檢測acyl-HSL信息分子的方法通常有幾種(1)物理學(xué)的檢測手段。我

11、們可以通過高效液相色譜技術(shù)來檢測純化的來自液體培養(yǎng)基的標(biāo)本。(2)運用某些細(xì)菌的色素或者熒光的產(chǎn)生受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)的機(jī)制來檢測acyl-HSL信息分子的存在，比如能產(chǎn)生紫色色素的紫色桿菌(Chromobacterium violaceum)。當(dāng)該細(xì)菌產(chǎn)生acyl-HSL信息分子的功能性基因被人為地刪除后，這時的變異株就成為acyl-HSL信息分子的生物感應(yīng)器，一旦該細(xì)菌遇到外源性的acyl-HSL分子時，就能產(chǎn)生紫色色素。一些帶有l(wèi)uxAB 和lacZ為基礎(chǔ)的熒光系統(tǒng)的質(zhì)粒也被裝載入某些細(xì)菌中，使得操作更為簡便。(3)將物理、化學(xué)的手段和生物發(fā)光感應(yīng)器結(jié)合起來檢測acyl-HSL分子，即薄

12、層層析。薄層層析的方法是在底層放置待測標(biāo)本及已知的標(biāo)準(zhǔn)物，在分離后上層覆蓋一層瓊脂，瓊脂內(nèi)含有特異性或非特異性發(fā)光感應(yīng)器的細(xì)菌，經(jīng)過數(shù)小時的孵育后，根據(jù)所得到的熒光位點與標(biāo)準(zhǔn)物的位點相比較，就可以得知待測物中是否含有acyl-HSL分子。2 細(xì)菌感知種間數(shù)量的信號群體感應(yīng)除了能控制基因表達(dá)外，還能在細(xì)菌種間交流中起作用。這種信號在革蘭氏陰性菌和陽性菌中都存在。這是在研究V.harveyi群體感應(yīng)系統(tǒng)時發(fā)現(xiàn)的。該菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)能識別AHL分子和Al-2分子，識別AHL分子能感知自身密度，識別Al-2分子能感知自身或其它細(xì)菌的數(shù)量（圖2）。AI-2分子是上下對稱的雙五元環(huán)結(jié)構(gòu)的呋喃酮酰硼酸二酯。

13、合成起始底物是腺苷甲硫氨酸（SAM），經(jīng)過一系列反應(yīng)，有l(wèi)uxS基因編碼的蛋白酶催化形成AI-2分子前體物，最后在硼離子的參與下形成呋喃酮酰硼酸二酯21。與具有種特異性的AHLs和寡膚類A1不同，一般認(rèn)為Al-2是種間細(xì)胞交流的通用信號分子22。例如在霍亂弧菌（V.cholerae）、腦膜炎奈瑟氏菌屬（Neisseria meningitidis）、化膿鏈球菌（S.pyogenes）中，AI-2分子調(diào)控基因的表達(dá)。在發(fā)光桿菌屬（Photorhabdus luminescens）中調(diào)控抗生素的合成。圖2 V.harveyi中的混合型群體感應(yīng)系統(tǒng)Fig 2. A hybrid quorum sen

14、sing system in V.harveyi在迄今為止所研究的能產(chǎn)生Al-2的菌株中，Al-2的生物合成途徑及合成過程中的中間體都是一樣的，且都需要LuxS蛋白的參與23。細(xì)菌識別AI-2分子的方式與革蘭氏陽性菌中雙組分識別系統(tǒng)完全一致，雙組分激酶識別Al-2分子后把磷酸化基團(tuán)傳遞給受體蛋白啟動相關(guān)基因的表達(dá)。AI-2信號同時存在于陽性和陰性細(xì)菌中，因此被視為是通用的細(xì)菌語言。3 目的和意義細(xì)菌的許多行為，包括發(fā)光、共生現(xiàn)象、生物膜的形成、毒性因子分泌、抗生素產(chǎn)生、色素產(chǎn)生、群體移動性、包子形成質(zhì)粒接合、基因交換以及發(fā)病機(jī)理等均受到群體感應(yīng)的調(diào)節(jié)24。在革蘭氏陰性菌中，已經(jīng)能夠證明AI-1

15、信號分子調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，例如在病原性銅綠假單胞菌能通過類似LuxR和Luxl蛋白的LasR和Lasl蛋白調(diào)控引起化膿的毒性基因的表達(dá)25。另外在人和動物的多種病原菌如耶爾森氏菌Yersinia26和氣單胞菌27，植物病原菌如假單胞菌、歐文氏菌和羅爾斯通菌及與植物共生的根瘤菌、桔黃假單胞菌中均存在 LuxR/Luxl類的調(diào)控系統(tǒng)。在根癌農(nóng)桿菌中也發(fā)現(xiàn)通過TraR和Tral蛋白調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞間的質(zhì)粒接合的群體感應(yīng)調(diào)節(jié)現(xiàn)象28。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)的研究，已成為國內(nèi)外研究的熱點之一。我國的科學(xué)家也開始重視這個領(lǐng)域的研究，開始了研究工作，對群體感應(yīng)的概述主要集中在群體感應(yīng)的基本原理、植物對細(xì)菌群體感應(yīng)的反

16、應(yīng)和群體感應(yīng)信號分子方面29-33。參考文獻(xiàn)1 Henke J Bassler B Bacterial social engagements J . Trends Cell Bio, 2004, 14( 11): 6482656.2 Kaplan H B,Greenberg E P. Diffusion of autoinducer is involved in regulation of the Vibrio fischeri luminescence system. Bactero,. 1985.163:1210-1124.3 Nealson K.H.，Hastings J.W. Bact

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