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文檔簡(jiǎn)介

1、 Immunoblottingl印跡技術(shù)印跡技術(shù)是將生物大分子物質(zhì)（核酸或蛋白質(zhì)）通過不同的途徑轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后與相應(yīng)的探針發(fā)生化學(xué)或免疫學(xué)反應(yīng)，顯示譜帶的一種方法。l分類：分類：nSouthern Blot: 分析DNAnNorthern Blot: 分析RNAnWestern Blot:分析蛋白質(zhì), 是將凝膠電泳與固相免疫相結(jié)合的一種復(fù)合免疫技術(shù),又稱免疫印跡。l通過SDS-PAGE將抗原按其分子量大小分離；l轉(zhuǎn)移到固相支持載體（硝酸纖維膜）上；l封閉空白位點(diǎn)；l再與抗體共孵育后，特異性抗體與抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物；l用酶標(biāo)抗體作為示蹤二抗；l加入能形成不溶性顯色物的酶底物，使目的條

2、帶顯色，對(duì)抗原進(jìn)行鑒定。電極電極膜膜膠膠濾紙濾紙轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移槽 優(yōu)優(yōu) 點(diǎn)：點(diǎn)：n同時(shí)具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測(cè)定的高特異性和敏感性；n方法簡(jiǎn)便；n標(biāo)本可長(zhǎng)期保存；n結(jié)果便于比較。u蛋白質(zhì)的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （已完成）u蛋白質(zhì)從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至硝纖膜 （已完成）u封閉硝纖膜的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn) （操作內(nèi)容）u酶標(biāo)抗體結(jié)合與染色 （操作內(nèi)容）lNC膜 1條/組l5脫脂奶粉 1ml/組l一抗溶液 1ml/組l酶標(biāo)抗體 1ml/組lPBS 10ml/組l小鑷子 1支/組l底物顯色液 10ml/班1.封閉：把NC膜（已轉(zhuǎn)印）放入小試管中，加入5脫脂奶粉1ml，塞上小膠塞，室溫下溫育1520分鐘，期間注意緩慢搖動(dòng)數(shù)次。2.打開膠塞，棄去封閉液，立即加入一抗溶液與濾膜一同溫育20分鐘。3.棄去液體，加PBS（2-3 ml）漂洗3次，每次3-5分鐘。4.加入1ml酶標(biāo)二抗，3745分鐘，不時(shí)搖動(dòng)。5.棄去液體，加入PBS（2-3ml）漂洗3次以上，每次3-5分鐘。6.加入底物DAB覆蓋NC

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