1、第第3篇：遺傳信息篇：遺傳信息第五章：基因工程與蛋白質工程第五章：基因工程與蛋白質工程第一節第一節 DNADNA重組和基因工程重組和基因工程 基因工程亦稱遺傳工程，即利用基因工程亦稱遺傳工程，即利用DNADNA重組技術的方法，把重組技術的方法，把DNADNA作為組件，在細胞外將一種外源作為組件，在細胞外將一種外源DNADNA（目的基因）和載體（目的基因）和載體DNADNA重重新組合連接（重組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因新組合連接（重組），最后將重組體轉入宿主細胞，使外源基因DNADNA在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（在宿主細胞中，隨細胞的繁殖而增殖（cloningcloning，

2、克隆），或，克隆），或最后得到表達，最終獲得基因表達產物或改變生物原有的遺傳性最后得到表達，最終獲得基因表達產物或改變生物原有的遺傳性狀。狀。一、一、DNADNA重組的技術路線重組的技術路線二、基因工程的應用與前景二、基因工程的應用與前景三、三、DNADNA體外重組常用的酶體外重組常用的酶DNA重組的重組的 技術路線技術路線Foreign DNA to be insertedPlansmid vectorJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infectio

3、n Host chromatemeSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeCloning+1、目的基因的制備、目的基因的制備2、載體的構建、載體的構建3、目的基因與載體、目的基因與載體的重組的重組4、重組、重組 體導入宿主體導入宿主細胞進行擴增細胞進行擴增5、克隆基因的鑒定、克隆基因的鑒定Ti質粒結構質粒結構植物冠癭瘤植物冠癭瘤pBR322質粒的結構質粒的結構以以 噬菌體為載體噬菌體為載體進行進行DNA克隆克隆 DNA用限制性內切酶用限制性內切酶除去中間一段除去中間一段與外源與外源DNA連接連接重組載體的體外包裝重組載體的體

4、外包裝帶有外源帶有外源DNA的的 噬菌體噬菌體太小不能被包裝太小不能被包裝頭部前體頭部前體多聯體多聯體DNAA蛋白蛋白COSCOSCOS成熟的顆粒成熟的顆粒在宿主細胞內進行在宿主細胞內進行DNA的裝配過程的裝配過程 噬菌體感染大腸桿菌的途徑噬菌體感染大腸桿菌的途徑DNA重組體的篩選重組體的篩選 載體特征的直接篩選載體特征的直接篩選 菌落的原位雜交菌落的原位雜交 免疫學方法免疫學方法pBR322質粒結構質粒結構 如果外源如果外源DNA插入，氨卞青霉素插入，氨卞青霉素抗性基因失活抗性基因失活 如果外源如果外源DNA插插入，四環素抗性基入，四環素抗性基因失活因失活原位雜交法篩選原位雜交法篩選DNA重

5、組體圖解重組體圖解復印至硝酸復印至硝酸纖維素膜上纖維素膜上用用NaOH菌體裂解菌體裂解DNA變性變性雜交雜交放射自顯影放射自顯影32P-cDNA與放射性與放射性cDNA雜雜交的菌落的斑點交的菌落的斑點細菌菌落細菌菌落單鏈單鏈DNA結結合到膜上合到膜上Southern印跡法印跡法DNA分子分子限制片段限制片段限制性酶切割限制性酶切割瓊脂糖電泳瓊脂糖電泳轉移至硝酸纖維素膜上轉移至硝酸纖維素膜上與放射性標記與放射性標記DNA探針雜交探針雜交放射自顯影放射自顯影帶有帶有DNA片片段的凝膠段的凝膠凝膠凝膠濾膜濾膜用緩沖液用緩沖液轉移轉移DNA吸附有吸附有DNA片段的膜片段的膜Southern和和West

6、ern印跡法印跡法DNA frangmentElectrophoresisTransfer of DNA by blotting32P-labled DNA probeAutoradiographyAgarrose gelAutoradiogramNitrocellulose sheetAutoradiogramPolymer sheetSDS-Polyacrylamide gelTransfer proteinAdd radiolabled spesfic antibody , Wash to remove unboud antibodyProtein band detected by sp

7、ecific antibodyAutoradiographyDNA重組技術的應用重組技術的應用 (1) 開辟生物學研究的新紀元開辟生物學研究的新紀元 反向生物學（反向生物學（invese biology）的誕生）的誕生（2）促進生物技術產業的興起）促進生物技術產業的興起 基因藥物基因藥物 基因診斷和治療基因診斷和治療 轉基因動植物轉基因動植物胰島素原的人工合成胰島素原的人工合成胰臟胰臟(A)n胰島素原胰島素原mRNAcDNA重組質粒重組質粒轉化細菌轉化細菌mRNA反轉錄酶反轉錄酶胰島素原基因胰島素原基因與質粒與質粒連接連接感染感染E.coli胰島素原胰島素原Ti質質粒粒為為載載體體的的植植物物

8、基基因因工工程程I 二元載體系統二元載體系統II 共整合載體共整合載體III T-DNA的轉移與整合的轉移與整合Ti輔助質粒輔助質粒Ti輔助輔助DNA給體質粒給體質粒Ti輔助輔助DNA給體質粒給體質粒 pBR型質粒（型質粒（給體質粒）給體質粒）宿主特宿主特異性異性外源基因外源基因宿主特宿主特異性異性整合整合帶有外源基因帶有外源基因的的Ti質粒質粒植物植物DNATi質粒轉移并插質粒轉移并插入植物入植物DNA第二節第二節 蛋白質工程簡介蛋白質工程簡介 蛋白質技術和核酸技術的相互增強蛋白質技術和核酸技術的相互增強 在廣泛利用自然界存在的各種蛋白質的過程中發現。這些蛋白在廣泛利用自然界存在的各種蛋白質

9、的過程中發現。這些蛋白質只是適應生物自身的需要，而對于它們的產業化開發往往并不合質只是適應生物自身的需要，而對于它們的產業化開發往往并不合意，需要加以改造。意，需要加以改造。1983年美國基因公司的年美國基因公司的Ulmer首先提出蛋白質首先提出蛋白質工程這個名詞，它是指按照特定的需要，對蛋白質進行分子設計和工程這個名詞，它是指按照特定的需要，對蛋白質進行分子設計和改造的工程。自此之后，蛋白質工程迅速發展，生物工程的重要組改造的工程。自此之后，蛋白質工程迅速發展，生物工程的重要組成部分。成部分。 蛋白質工程首先是以蛋白質的結構為基礎，通過蛋白質一級結蛋白質工程首先是以蛋白質的結構為基礎，通過蛋

10、白質一級結構、晶體結構和溶液構象的研究，積累成千上萬蛋白質一級結構和構、晶體結構和溶液構象的研究，積累成千上萬蛋白質一級結構和高級結構的數據資料高級結構的數據資料，然后按照蛋白質形成的規律，經周密的分，然后按照蛋白質形成的規律，經周密的分子設計，改造蛋白質或構建新的蛋白質。子設計，改造蛋白質或構建新的蛋白質。 研究得多，取得成果最顯著的是生物技術藥（激素、細胞因研究得多，取得成果最顯著的是生物技術藥（激素、細胞因子、酶、酶的激活劑、受體和配體、細胞毒素和殺菌肽以及抗子、酶、酶的激活劑、受體和配體、細胞毒素和殺菌肽以及抗體等）和工業用酶的蛋白質工程。體等）和工業用酶的蛋白質工程。生物酶工程示意圖

11、生物酶工程示意圖酶的蛋白質結構功能酶的蛋白質結構功能新酶分子藍圖新酶分子藍圖選擇性修飾方案選擇性修飾方案突變酶突變酶 新酶新酶克隆酶克隆酶產品產品效用效用發發展展酶基因酶基因遺傳設計遺傳設計遺傳修飾遺傳修飾DNA重組重組技術技術DNA重組重組技術技術蛋白質技術和核酸技術的相互增強蛋白質技術和核酸技術的相互增強插入表達載體插入表達載體轉化寄主細胞轉化寄主細胞推導出推導出AA順序順序制備合成肽制備合成肽制備對所編碼蛋白制備對所編碼蛋白專一的抗體專一的抗體基因或基因或cDNA蛋白質蛋白質蛋白質蛋白質測定出測定出AA順序順序合成合成cDNA探針探針制備專一的抗體制備專一的抗體沉淀核糖體沉淀核糖體分離分

12、離mRNA用用Southern印跡法印跡法篩選篩選DNA文庫文庫基因或基因或cDNA第三節第三節 核酸研究技術簡介核酸研究技術簡介一、一、DNA序列測定序列測定二、基因文庫與二、基因文庫與cDNA文庫文庫三、聚合酶鏈式反應（三、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）DNA測序的基本戰略測序的基本戰略 設法產生帶標記的不同長度的成套設法產生帶標記的不同長度的成套DNA片片段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，段，各帶有標記的片段起點相同、終點不同，使待測的使待測的DNA鏈中的相應每個核苷酸處都有斷鏈中的相應每個核苷酸處都有斷裂或終止。通過裂或終止。通過P

13、AGE電泳，能夠將相差一個電泳，能夠將相差一個核苷酸的核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據片段分開，放射自顯影后，根據長短排列，根據特定末端堿基的長短排列，根據特定末端堿基的DNA片段就可片段就可讀出待測讀出待測DNA的堿基序列。的堿基序列。 酶法酶法 化學法化學法 測序技術進展測序技術進展酶酶法法序序列列分分析析的的原原理理 酶酶反反應應電電泳泳方方向向模板模板CCGGTAGCAACT3 5 GG5 3 引物引物dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTP

14、GGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGTTGGGCCATCGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTA C G TAGTTGCTACC3 5 TCAACGATGG5 3 讀出模板讀出模板互補序列互補序列讀出模板讀出模板序列序列GGCCATCGTTGAGGCCATCGTGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGGGCCATCGGCCAGGCCATGGCCGGCDNA的的Sanger測序法測序法(酶法酶法) 讀出模板互讀出模板互補序列補序列dNTP 凝膠電泳凝膠電泳 較大片段較大片段 較小片段較小片段ddGTPddATPddCTP

15、ddTTP 反應混合物反應混合物Klenow酶酶 未知序列的單鏈未知序列的單鏈DNA 讀出待測讀出待測序列序列CTGACTTCGACAAAGAA5 3 放射性標記的引物放射性標記的引物TGTTA C T GddGddGddGddGGACTGAAGCTGTT3 5 CTGACTTCGACAA5 3 DNA的測序儀示意圖的測序儀示意圖computer analysis凝膠中凝膠中DNA移動方向移動方向樣品槽樣品槽激光器激光器輸入光學系統輸入光學系統成象透鏡成象透鏡聚焦透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機高靈敏度相機旋光鏡旋光鏡/棱鏡組件棱鏡組件DNA的化學測序示意圖的化學測序示意圖 反應試劑反應試劑G反應：硫

16、酸二甲酯反應：硫酸二甲酯G+A反應：甲酸反應：甲酸T+C反應：肼反應：肼C反應：反應：NaCl+肼肼測序技術進展測序技術進展同位素標記到熒光標記同位素標記到熒光標記,平板電泳到毛細管電泳平板電泳到毛細管電泳多色熒光標記多色熒光標記毛細管電泳毛細管電泳 單色熒光標記單色熒光標記平板電泳平板電泳同位素標記同位素標記平板電泳平板電泳A C G TA C GT測序圖譜測序圖譜T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T一個樣本，一個樣本，4個反應。個反應。4個反應中引物序列相同，但分別標記有不同顏色的熒光。個反應中引物序列相同，但分別標記有不同顏色的熒光。+AmpliTaq FS e

17、nzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddATP (terminator)+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddCTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddGTP+AmpliTaq FS enzymedCTP, dATP, dGTP, dTTPddTTP 反應結束后，反應結束后，將將4管反應液混管反應液混合，經乙醇沉淀合，經乙醇沉淀后上樣后上樣一個樣本，一個樣本，1個反應。反應中包含分別帶個反應。反應中包含分別帶4色熒光標記的色熒光標記的ddNTP(終止子終止子)unlabeled

18、primertemplate DNA+AmpliTaq FSdATP, dCTP, dGTP, dTTPddCTPddATPddGTPddTTP三基因文庫與三基因文庫與cDNA文庫文庫1基因文庫（基因文庫（genomic library） cDNA文庫（文庫（complemental DNA library）2 . 文庫的構建文庫的構建 基因文庫基因文庫 基因文庫是指整套由基因組基因文庫是指整套由基因組DNA片段插入克隆載體獲得的分片段插入克隆載體獲得的分子克隆之總和。應用子克隆之總和。應用DNA重組技術，可以將各種生物體全部基因重組技術，可以將各種生物體全部基因組的遺傳信息，貯存在可以長期保

19、存的穩定重組體中，以備需要組的遺傳信息，貯存在可以長期保存的穩定重組體中，以備需要時應用。好象將文獻資料貯存于圖書館一樣，所以稱其為時應用。好象將文獻資料貯存于圖書館一樣，所以稱其為genomic library。 基因文庫中應包含多少基因文庫中應包含多少DNA克隆才能使任意所需要的基因以克隆才能使任意所需要的基因以極高的概率存在于該文庫中？其計算公式如下：極高的概率存在于該文庫中？其計算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-f) N 基因文庫所包含克隆的數目；基因文庫所包含克隆的數目； p 任意所需基因存在于基因文庫中的概率，要求大于任意所需基因存在于基因文庫中的概率，要求大于99%；

20、f 克隆的克隆的DNA片段大小（片段大小（bp）占基因組大小）占基因組大小(bp)的分數。的分數。cDNA文庫文庫 真核細胞基因是斷裂的，在基因最后產物中表達的編碼序列（外顯真核細胞基因是斷裂的，在基因最后產物中表達的編碼序列（外顯子）被非編碼序列（內含子）分隔開，需經子）被非編碼序列（內含子）分隔開，需經RNA轉錄后加工過程才使編轉錄后加工過程才使編碼序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表達，只有將加工成碼序列拼接在一起。真核生物基因不能在原核生物中表達，只有將加工成熟的熟的mRNA反轉錄成反轉錄成cDNA （complemental DNA）接上原核生物表達控）接上原核生物表達控制

21、元件，才能在原核生物中表達。再有，真核生物的基因通常只有一小部制元件，才能在原核生物中表達。再有，真核生物的基因通常只有一小部分進行表達，由于分進行表達，由于mRNA的不穩定性，對基因表達和有關的不穩定性，對基因表達和有關mRNA都通常通都通常通過對其過對其cDNA來進行研究的。將細胞全部來進行研究的。將細胞全部mRNA反轉錄成反轉錄成cDNA并被克隆并被克隆的總和稱為的總和稱為cDNA文庫。文庫。 RNA病毒的基因組是病毒的基因組是RNA，也必須將，也必須將RNA先轉先轉錄成錄成cDNA，再建立文庫。，再建立文庫。 為使低豐度的為使低豐度的mRNA的的cDNA克隆存在的概率大于克隆存在的概率

22、大于99%，cDNA文庫文庫應含的克隆數的計算公式如下：應含的克隆數的計算公式如下： N=ln(1-p)/ln(1-1/n) N cDNA文庫所包含克隆的數目；文庫所包含克隆的數目； p 低豐度低豐度cDNA存在于基因文庫中的概率，要求其大于存在于基因文庫中的概率，要求其大于99%； 1/n 每一種低豐度的每一種低豐度的mRNA占總占總 mRNA的分數。的分數。基因文庫和基因文庫和cDNA文庫的建立文庫的建立組織組織可克隆之可克隆之DNA載體載體DNAcDNAmRNA部分或完全部分或完全酶解酶解DNADNA長度分級長度分級甲基化，雙鏈甲基化，雙鏈接頭接頭DNADNA與載體連接與載體連接引入大腸

23、桿菌引入大腸桿菌鑒定文庫的滴度和特性鑒定文庫的滴度和特性擴增后供擴增后供長期儲存長期儲存篩選出所需篩選出所需要的克隆要的克隆噬噬菌菌體體為為載載體體的的基基因因文文庫庫的的構構建建四、聚合酶鏈式反應（四、聚合酶鏈式反應（PCR） 1985年年Mullis發明發明PCR（ polymerase chain reaction）快速擴增快速擴增DNA的方法。該法模仿體內的方法。該法模仿體內DNA的復制過程，首先使的復制過程，首先使DNA變性，兩條變性，兩條鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對，鏈解開，然后使引物模板退火，二者堿基配對，DNA聚合酶隨即以聚合酶隨即以4種種dNTP為底物，在引物的引

24、導下合成與模板互補的為底物，在引物的引導下合成與模板互補的DNA新鏈。重復此過新鏈。重復此過程，程，DNA以指數方式擴增。擴增的公式為以指數方式擴增。擴增的公式為: Y=(1+X)n 式中式中 y一產量一產量; X-擴增效率擴增效率; n一循環次數。一循環次數。（2） PCR的應用的應用 （1）PCR的原理的原理 PCR技術原理示意圖技術原理示意圖靶序列靶序列變性和引變性和引物復姓物復姓循環循環1循環循環2循環循環3變性和引變性和引物復姓物復姓鏈延伸鏈延伸Tag酶酶鏈延伸鏈延伸PCR技術的發展與應用技術的發展與應用 用于合成特異探針；用于合成特異探針； 用于用于DNA的測序；的測序； 將逆轉錄與將逆轉錄與PCR相偶聯相偶聯 （RT-PCR）；）； 用于基因定位誘變；用于基因定位誘變； 末知序列的末知序列的PCR擴增；擴增； 基因組序列的比較研究；基因組序列的