1、第一章第一章 血液標本采集與處理血液標本采集與處理臨床免疫學檢驗技術第十四章臨床免疫檢驗的自動化第十四章臨床免疫檢驗的自動化分析分析陶志華目 錄第一節 免疫濁度測定的自動化分析一、免疫散射比濁測定的自動化分析二、免疫散射比濁測定的影響因素第二節 發光免疫測定的自動化分析一、吖啶酯標記化學發光測定的自動化分析二、酶聯發光免疫測定的自動化分析三、電化學發光免疫測定的自動化分析四、發光氧通道免疫測定的自動化分析目 錄第三節 熒光免疫測定的自動化分析一、時間分辨熒光免疫測定的自動化分析二、熒光偏振免疫測定的自動化分析第四節 酶聯免疫測定的自動化分析第五節 臨床免疫檢驗自動化分析的選擇與應用一、臨床免疫

2、檢驗自動化分析的選擇原則二、臨床免疫檢驗自動化分析的臨床應用重點提示臨床免疫檢驗的自動化分析(automation of immunoassays) 是將免疫學檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數據處理、結果報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，儀器自動完成整個免疫檢驗過程。重點提示各種自動化免疫分析儀都使用一種或兩種免疫分析技術，如酶聯免疫分析技術、生物素-親合素技術、化學發光分析技術、熒光偏振免疫測定技術、時間分辨熒光免疫測定技術、電化學發光免疫分析技術等。有些免疫檢驗如免疫透射比濁則可采用全自動生化分析儀進行檢測，有些則整合在其它一些自動化分析系統中，如自

3、動化血凝分析儀。重點提示通過本章學習，學生將全面掌握臨床上常用的全自動免疫分析儀的類型、儀器檢測技術要點和影響因素。通過本章學習，學生還將了解臨床實驗室選擇選擇原則和臨床應用。第一節第一節 免疫濁度測定的自動化分析免疫濁度測定的自動化分析免疫濁度分析的基本原理抗原、抗體在特定的電解質溶液中反應，形成小分子免疫復合物（19S），使反應液出現濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復合物量隨抗原量的增加而增加，反應液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應溶液的濁度呈正相關。 II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24免疫散射比濁儀粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后

4、，微粒子對光線產生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關，其公式如下：式式I I 中為與入射光成中為與入射光成角處散射光強度；角處散射光強度；和和I0I0為入射光的波長和強度；為入射光的波長和強度；dn/dcdn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數和顆粒濃度的變化；為校正因子，反映了溶液折射指數和顆粒濃度的變化；M M為顆粒分子量；為顆粒分子量；c c為濃度；為濃度；N N為阿佛加德指數；為阿佛加德指數；為顆粒到檢測器的距離；為顆粒到檢測器的距離；為散射光與入射光為散射光與入射光的夾角（散射夾角）。的夾角（散射夾角

5、）。定時散射比濁法（fixed time nephelometry）檢測檢測原理：原理：定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應立即開始，在反應的第一階段，溶液中產生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結果會產生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應的不穩定階段，即散射光信號在開始反應7.5s2min內的第一次讀數，專門在抗原抗體反應的最佳時段進行讀數，將檢測誤差降到最低。 儀器測定技術儀器測定技術要點：要點： 1.抗原抗體預反應階段 2.反應階段3.信號檢測4.抗原過剩檢測 (1) 抗體適當過量 (2) 對抗原過量進行閾值限定 定時散射比濁法（fixed t

6、ime nephelometry）速率散射比濁法（rate nephelometry）速率散射比濁法是抗原抗體結合反應的動力學測定法。所謂速率是指抗原抗體反應在單位時間內形成免疫復合物的量（不是免疫復合物累積的量），連續測定各時間復合物形成的速率與其產生的散射光信號聯系在一起，形成動態的速率散射比濁法，每項檢測僅1min2min即可完成。 抗原抗體反應速率的動態變化抗原抗體反應速率的動態變化儀器測定技術儀器測定技術要點：要點：開啟機器，進行校準反應階段 抗原過量檢測 速率散射比濁法（rate nephelometry）BN ProSpec全自動特定蛋白分析儀全自動特定蛋白分析儀IMMAGE全自

7、動特定蛋白分析儀全自動特定蛋白分析儀免疫散射比濁儀方法評價散射比濁法是目前臨床應用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優點。采用抗原過量檢測方法，保證了結果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴, 對抗體的質量要求很高。免疫比濁分析的影響因素1.抗原抗體比例2.抗體的質量3.增濁劑的使用4.偽濁度5.入射光光源和波長6.校準曲線制備與質量控制第二節第二節 發光免疫測定的自動化分析發光免疫測定的自動化分析發光免疫測定的自動化分析發光免疫測定的自動化分析是通過抗原或抗體標記技術、抗原或抗體的抗原抗體反應、固相分離技術、發光技術和計算機信息技術進行有機整合，實現了加樣、溫育、固相

8、載體分離清洗、發光信號檢測和數據處理等過程自動化。一、吖啶酯標記化學發光免疫分析儀吖啶酯標記的化學發光免疫分析儀是一種用發光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學發光技術和磁性微粒子分離技術，以吖啶酯為化學發光劑，以細小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結合法等相同。 磁微粒分離技術Y YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY YY Y順磁性微粒示意圖順磁性微粒示意圖 磁微粒技磁微粒技術術 磁

9、磁微粒微粒在在電磁場中電磁場中分離分離磁磁微微粒粒標記抗體標記抗體發光發光Y YY磁微粒磁微粒被測抗原被測抗原+抗體抗體+帶丫啶帶丫啶酯標記酯標記物抗體物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后沖洗后雙抗體夾心法雙抗體夾心法（1 1）加入酸性加入酸性H H2 2O O2 2（pH10）儀器測定技術要點吖啶酯標記化學發光免疫分析儀ACS：180 SEACS CENTAURci8200i2000sr酶聯發光免疫分析儀酶聯發光免疫分析儀是用參與催化某一化學發光或熒光反應的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應后，加入底物(發光劑)，由酶催化和分解底物發光，通過光信號的強弱來進行被測物的定量。常用的標記酶有辣根過

10、氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。 辣根過氧化物酶標記的化學發光免疫分析儀該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學發光劑，還利用增強劑使化學發光強度增加、時間延長。魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產生魯米諾衍生物（激發態）。它以光量子輻射形式返回基態時，發出微綠色可見光。魯米諾增強化學發光的原理儀器測定技術要點全自動增強化學發光酶免分析儀堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析儀該儀器是以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學發光劑進行測定的自動化儀

11、器。儀器測定技術要點 AccessAccess全自動酶標記化學發光免疫分析儀全自動酶標記化學發光免疫分析儀UniCelUniCelDxI DxI 800800全自動酶標記化學發光免疫分析儀全自動酶標記化學發光免疫分析儀IMMULITE 2000IMMULITE 2000型全自動酶標記化學發光免疫分析系統型全自動酶標記化學發光免疫分析系統堿性磷酸酶標記的化學發光免疫分析儀堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀 該儀器以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原），以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應的熒光基質（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團，形成4-甲基傘型酮

12、(4-MU)，用360nm激發光照射，發出450nm的熒光。 儀器測定技術要點AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀全自動酶標記熒光免疫分析儀堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀 電化學發光免疫分析儀電化學發光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學引發的特異性化學發光反應，它包括電化學和化學發光兩個過程。電化學發光免疫分析儀是采用電化學發光技術，生物素放大技術，以順磁性微粒為固相載體，用三聯吡啶釕標記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設計的一種自動化分析儀器。電化學發光穩定、持續時間長，易于控制并可根據待測分子的大小設計成多種反應模式如夾心法、競爭法等。 儀器測定技術要點抗原抗體

13、結合 電化學發光反應 光信號檢測 檢測完畢 全自動電化學發光免疫分析儀發光氧通道免疫分析儀是一種整合了高分子納米微粒、免疫化學、CPM單光子計數技術的新型的均相化學發光免疫分析儀，所采用的均相化學發光技術具有快速、均相（免沖洗）、高靈敏和操作簡單的特點。發光氧通道免疫分析儀以雙抗體夾心法為例1. 抗原抗體結合 將抗體包被感光微粒、抗體包被發光微粒和待測標本加入反應杯中，經溫育后，形成抗體包被感光微粒-抗原-抗體包被發光微粒復合物。 2. 信號檢測 用光子計數器計數得到相對光量子單位(RLU)值，光的強度與待測抗原的濃度成正比，通過校準曲線計算抗原濃度。儀器測定技術要點第三節第三節 熒光免疫測定

14、的自動化分析熒光免疫測定的自動化分析自動化熒光免疫分析儀主要是將抗原抗體結合反應與熒光物質發光分析和計算機技術有機結合的一項自動化免疫分析儀器。根據抗原抗體反應后是否需要進行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。 時間分辨熒光免疫分析儀是采用鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術相結合，而建立起來的一種熒光免疫分析儀器，所采用時間分辨熒光免疫分析技術具有靈敏度高，鑭系元素發光穩定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，校準曲線范圍寬等特點。儀器測定技術要點 抗原抗體結合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸

15、性增強液 4. 信號檢測 時間分辨熒光免疫分析儀auto DELFIAauto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統全自動時間分辨熒光免疫檢測系統熒光偏振免疫分析儀是采用均相熒光免疫測定原理設計的一臺熒光免疫分析儀。該儀器利用熒光物質在溶液中被單一平面的偏振光（波長485nm）照射后，可吸收光能而產生另一單一平面的偏振發射熒光（波長525nm）。該熒光強度與熒光標記物質在溶液中旋轉的速度與分子大小呈反比。常采用抗原抗體競爭反應原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。儀器測定技術要點1. 抗原抗體反應 2.偏振熒光強度測定 注意事項1.FPIA的結果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發態

16、熒光的平均壽命、抗原的相對分子量和復合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進行預處理，除去干擾成分。 第四節第四節 酶聯免疫測定的自動化分析酶聯免疫測定的自動化分析酶聯免疫測定的自動化分析酶聯免疫測定的自動化分析是將酶聯免疫吸附試驗（ELISA）各種操作步驟（加樣溫育洗滌加酶結合物溫育洗滌加底物溫育比色等）進行自動機器操作，實現自動化分析的免疫檢測系統。 根據自動化酶聯免疫分析系統的處理模式不同，通常將全自動酶免分析儀分成二類：分體機和連體機。分體機是由“前處理系統”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用

17、一臺計算機、一套操作系統實現了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數和結果打印的全自動過程。 儀器組成和性能1.條形碼識別系統 2.樣本架和加樣系統 3.試劑架 4.溫育系統5.液路系統 6.洗板系統 7.酶標板讀數儀 8.自動裝載傳遞系統 9.計算機管理和信息系統加樣加樣儀器組成和性能洗板洗板儀器組成和性能全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。 儀器評價第五節第五節 臨床免疫

18、檢驗自動化分析的選擇與應用臨床免疫檢驗自動化分析的選擇與應用選擇原則1.資質要求： 企業法人營業執照、醫療器械注冊證和醫療器械生產/經營企業許可證2.性能要求： 性能指標（正確度、精密度、最低檢測限、線性范圍和臨床可報告區間、分析干擾等）；還應考慮檢驗科內部儀器所組成檢測系統的一致性和測定結果的可比性。3.儀器放置地的設施和環境條件 4.實驗室項目檢測速度要求和設備配置5.信息要求6.實驗室檢測項目的經濟效益因素臨床應用1.血漿、體液中的特定蛋白檢測2.甲狀腺激素及相關指標檢測3. 生殖激素檢測4. 腎上腺和垂體激素檢測5. 貧血因子檢測6. 腫瘤標記物檢測 如 AFP、CEA、PSA、fPS

19、A、CA19-9、CA125、CA15-3等。7. 感染性疾病免疫學指標檢測8. 糖尿病免疫學指標檢測9. 治療藥物濃度檢測 如茶堿、地高辛、環孢素、苯巴比妥血藥濃度測定等思考題1.什么是免疫檢驗自動化？應用哪些技術？優點是什么？2.免疫濁度分析的原理是什么？有哪些臨床應用？3.定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點？4.免疫比濁分析的影響因素有哪些？5.吖啶酯標記的化學發光免疫分析儀技術要點是什么？6.酶聯發光免疫分析儀的原理是什么？有哪幾種類型？各有什么特點？7.電化學發光免疫分析儀測定的技術要點是什么？8.光致發光化學免疫分析儀測定原理和技術要點是什么？9.時間分辨熒光免疫分析儀測定的技術要點是什么？注意事項有哪些？10.全自動酶免分析儀的組成成分有哪些？優點是什么？小結臨床免疫檢驗自動化分析是將免疫學檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數據處理、結果報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，儀器自動完成整個免疫檢驗過程。臨床免疫檢驗自動化分析是通過采用一種或兩種免疫分析技術和相應專用臨床免疫檢驗自動化