1、安徽農業科學,JournalofAnhuiAgr.iSc.i2010,38(34):19335-19337,19340責任編輯 姜麗 責任校對 傅真治薄荷葉中黃酮類物質的提取及其抗氧化活性研究邱賀媛,章宋潔(韓山師范學院化學系,廣東潮州521041)摘要 目的優化薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)葉總黃酮提取工藝,并研究其抗氧化活性,為薄荷葉總黃酮的提取利用提供依據。4方法在單因素試驗基礎上,以黃酮提取率為指標,采用L9(3)正交試驗,對超聲波輔助提取,薄荷葉中的黃酮類物質的工藝進行優選。并研究薄荷葉水提液和乙醇提取液對 OH的清除作用。結果薄荷葉中總黃酮的最佳工藝為:以體積分

2、數40%乙醇為溶劑,料液比1 30(W/V),超聲波功率400W,提取溫度50!,提取時間40min,此優化條件下,薄荷葉總黃酮得率達6.58%。薄荷葉水提液對 OH有較強的清除作用,且隨著總黃酮含量的增加逐漸增大,最高消除率達到44.23%;薄荷葉乙醇提液對 OH的清除作用隨著黃酮含量的增加先緩慢上升后持續快速下降,總體上低于薄荷葉水提液對 OH的清除作用。結論利用超聲波協同乙醇提取薄荷葉中黃酮類物質的方法簡單,可操作性強。薄荷葉中黃酮類物質對 OH有較強的清除作用,可以開發利用。關鍵詞 薄荷葉;總黃酮;超聲波輔助提取法; OH;清除作用+中圖分類號 S367.235 文獻標識碼 A 文章編

3、號 0517-6611(2010)34-19335-03StudyonExtractingandAntioxidantActivityofFlavonoidsfromMenthahaplocalyxBriq.QIUHe yuanetal (DepartmentofChemistry,HanshanNormalUniversity,Chaozhou,Guangdong521041)Abstract ObjectiveTheresearchamiedtooptmiizetheextractionprocessofflavonoidsfromMenthahaplocalyxBriq.leavesan

4、dstudyitsan tioxidantactivitysoastoprovidethebasisforextractionandutilizationofflavonoidsfromMenthahaplocalyxBriq.leaves.MethodTakingex4tractionratioofthetotalflavonoidsasindex,L9(3)orthogonaltestwasusedtooptmiizetheextractionprocessofflavonoidsfromMenthahaplo calyxBriq.leavesbyultrasound assistedex

5、traction.AndtheclearingrateofwaterandethonalextractofMenthahaplocalyxBriq.leavesto OHwasstudied.ResultTheresultsshowedthattheoptmialprocessofextractingflavonoidsfromMenthahaplocalyxBriq.leaveswasasfollow:etha nolconcentration40%,solid liquidratioof1 30,ultrasonicpower400W,extractiontemperature50!,an

6、dextractiontmie40min.Undertheop tmialconditions,theyieldofflavonoidsfromMenthahaplocalyxBriq.leaveswas6.58%.ThewaterextractofMenthahaplocalyxBriq.leaveshadstrongclearingeffectto OH,andgraduallyincreasedwiththeraisingofflavonoidsconten;tThebiggestclearingratewas44.23%.Theclearingeffectofethonalextrac

7、tofMenthahaplocalyxBriq.leavesto OHincreasedslowlyfirs,tthendecreasedquicklyandcontinuouslywiththeraisingofflavonoidsconten,tbutlessthantheeffectofitswaterextractinwhole.ConclusionThemethodofextractingflavonoidsfromleavesofMenthahaplocalyxBriq.byusingethanolandultrasonicwassmiple,andhadstrongmaneuve

8、rability.TheflavonoidsfromleavesofMenthahaplocalyxBriq.hadstrongclearingeffectto OH,andcouldbedevelopedandused.Keywords MenthahaplocalyxBriq.leaves;Flavonoids;Ultrasound assistedextraction; OH;Clearingeffect薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)又稱夜息香、魚香菜、狗肉香、水益母和魚香草等,為唇形科(Labiatae)薄荷屬(Men tha)1年或多年生宿根性草本植物,是一種生長

9、在低地、路邊、河灘、湖邊以及園地等處可以藥食兼用的野菜,且是一種具有特種經濟價值的芳香作物。薄荷全草均可入藥,味辛、涼,歸肺、肝經,有發散風熱、清利咽喉、透疹解毒、疏肝解郁和止癢等功效,可用于治療感冒發熱、頭痛、咽喉腫痛、無汗、風火赤眼、風疹、皮膚發癢、疝痛、下痢及瘰疬等癥,外用有輕微的止痛作用,可用于神經痛等。薄荷嫩葉除了含有豐富的蛋白質、脂肪和碳水化合物之外,還含有鈣、磷、鐵、多種維生素和人體必需的微量元素,而可溶性有害重金屬(Pb、Cr和Cd)等含量很低。近年來,國內外學者對唇形科很多種植物的生物學特性進行了大量研究,發現其具有廣泛的藥理作用。但目前,關于薄荷中黃酮類化合物的研究尚未見報

10、道。為此,筆者以乙醇作提取劑,采用單因素試驗和正交試驗優化超聲波輔助提取薄荷葉中的黃酮類化合物的工藝,并研究薄荷葉提取液中黃酮類物質對羥基自由基( OH)的清除作用,旨在為建立快速、高效的從薄荷葉中提取、分離黃酮類化合物的方法及進一步開發利用薄荷葉提供科學依據。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 供試藥材。薄荷葉,購自廣東省潮州市中藥店,由韓山作者簡介 邱賀媛(1965-),女,河北昌黎人,高級實驗師,從事有機化學和食品化學的教學與研究工作。收稿日期 2010 08 231-3師范學院生物系曾憲鋒副教授鑒定為薄荷(MenthahaplocalyxBriq.)正品。粉碎,于干燥箱中60!干燥至

11、恒重,冷卻,備用。1.1.2 主要試劑。蘆丁標準品,生化試劑,由上海試劑二廠生產;無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸,均為分析純,由廣州試劑廠生產。1.1.3 主要儀器。Spectrumlab752S型紫外可見分光光度計,由上海棱光技術有限公司生產;KQ 500DB型數控超聲波清洗器,由昆山市超聲儀器有限公司生產;JFSD 100 型粉碎機,由上海華巖儀器設備有限公司生產;JA1203型上皿電子天平,由上海精密科學儀器有限公司生產;SHZ D(#)型循環水式真空泵由鞏義市予華儀器有限責任公司生產;DF 02型精密恒溫水槽,由南京舫奧科技有限公司生產;DZF 605

12、0型真空干燥箱,由上海博訊實業有限公司醫療設備廠生產;GZH DH X型電熱恒溫干燥箱,由上海躍進醫療機械廠生產。1.2 方法1.2.1 薄荷中總黃酮的提取。稱取一定量薄荷葉,研碎,準確稱取1.0000g于碘量瓶中,加入一定體積分數的乙醇,設提取溫度為50!,在一定超聲波功率下提取一定時間,冷卻,過濾,將濾液定容至250m,l即得總黃酮提取液。1.2.2 單因素試驗。1.2.2.1 乙醇體積分數的選擇。準確稱取5份薄荷葉粉末,各1.0000g,設料液比為1 30(W/V,下同),分別用30%、40%、50%、60%、70%乙醇溶液浸泡,在超聲波功率為400W、提取溫度為50!的條件下,超聲提取

13、30min,冷卻,過濾,將濾液定容至250m,l測定吸光度值,研究乙醇體積分數對19336安徽農業科學 2010年1.2.2.2 料液比的選擇。準確稱取5份薄荷葉粉末,各1.0000g,設料液比分別用1 10、1 20、1 30、1 40、1 50,用40%乙醇溶液浸泡,在超聲波功率為400W、提取溫度為50!的條件下,超聲提取30min,冷卻,過濾,將濾液定容至250ml測定吸光度值,研究料液比對薄荷葉總黃酮提取率的影響。1.2.2.3 超聲波功率的選擇。準確稱取5份薄荷葉粉末,各1.0000g,各設料液比為1 20,分別用40%乙醇浸泡,在提取溫度為50!、超聲波功率分別為300、350、

14、400、450、500W的條件下提取30min,冷卻,過濾,將濾液定容至250ml測定吸光度值,研究超聲波功率對薄荷葉總黃酮提取率的影響。1.2.2.4 提取時間的選擇。準確稱取5份薄荷葉粉末,各1.0000g,設料液比為1 20,分別用40%乙醇浸泡,在提取溫度為50!、超聲波功率為400W的條件下,分別提取10、20、30、40、50min,冷卻,過濾,將濾液定容至250ml測定吸光度值,研究提取時間對薄荷葉總黃酮提取率的影響。1.2.3 正交試驗。在單因素試驗基礎上,選取乙醇體積分數、料液比、超聲波功率和提取時間4個因素,每個因素3個水平,進行L9(3)正交試驗,以黃酮得率為考察指標,優

15、化從薄荷葉中提取總黃酮的工藝。各因素與水平設計見表1。表1 L9(3)正交試驗因素與水平設計Table1 FactorsandlevelsdesignofL9(3)orthogonaltest水平Level123料液比ASolid liquidratio1 101 201 30超聲波功率BWUltrasonicpower708090提取時間CminExtractiontime304050乙醇體積分數D/%Volumefractionofethanol30405044式中,C為由標準曲線計算得到的總黃酮濃度(mg/ml);10為測試定容體積(ml);250為待測液總體積(ml);2為測試液體積(

16、ml)。1.2.5 OH清除率的測定。將按最佳工藝得到的乙醇提取液定容至250m,l測定其對 OH的清除率;以蒸餾水代替乙醇進行提取,得到水提取液,定容至250m,l測定其對 OH的清除率。取5根50ml比色管,依次加入2mmol/LFeSO43.0ml、1mmol/LH2O23.0m,l搖勻,再加入6mmol/L水楊酸3.0m,l搖勻,在37!下水浴15min,取出,在波長510nm處測定吸光度值A0(空白)。分別向5根比色管中加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml已知濃度的黃酮提取液,再分別加入0.8、0.6、0.4、0.2、0ml水,搖勻,再在37!下水浴15min,取出,測得吸

17、光度值Ax。平行測定3次,計算清除率。其計算公式為:OH清除率(%)=(Ax-A0)(Ax100%式中,Ax為反應體系原來的吸光度,A0為加入提取液后的吸光度。2 結果與分析2.1 單因素試驗2.1.1 乙醇體積分數對薄荷葉中總黃酮提取率的影響。由圖1可知,隨著乙醇體積分數的增加,總黃酮的提取率開始逐漸增加,但當乙醇體積分數超過40%時,總黃酮的提取率反而降低。這可能是由于一些醇溶性雜質、色素等成分溶出量增加,這些成分與黃酮類化合物競爭,同乙醇)水分子結合,從而導致黃酮類化合物的提取量下降。故乙醇體積分數以40%為宜。5-741.2.4 總黃酮含量的測定。41.2.4.1 蘆丁標準曲線的繪制。

18、準確稱取于105!下烘至恒重的蘆丁標準試劑0.0309g,用60%乙醇溶解,并完全轉入50ml容量瓶中,用60%乙醇定容至刻度,搖勻,得0.618mg/ml的蘆丁標準溶液。分別吸取上述蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml于7支10ml比色管中,分別加入60%乙醇至約5m,l再加入0.3ml5%NaNO2溶液,搖勻,靜置5min后加入0.3ml10%Al(NO3)3溶液,搖勻,靜置6min后再加入4.0ml1mol/LNaOH溶液,搖勻,用60%乙醇定容至刻度,靜置15min后在波長510nm處測定吸光度值,用空白試劑作參比。以吸光度值(y)對蘆丁標準溶液濃度(g)

19、作圖,用最小二乘法進行線性回歸,得線性回歸方程:y=10.105x0.025,r=0.9966,表明蘆丁標準品溶液濃度在00.18mg/ml范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。1.2.4.2 含量測定。吸取2ml待測溶液于10ml比色管中,按照%1.2.4.1&的相應步驟操作,測定吸光度值,根據得到的線性回歸方程,計算每毫升提取液中總黃酮含量,再換算成每克干薄荷葉粉中的總黃酮量,并計算總黃酮得率。3次重復,取平均值。計算公式為:總黃酮含量(mg)=C10250/2總黃酮得率=(總黃酮含量/薄荷葉粉末質量)100%圖1 乙醇體積分數對薄荷葉總黃酮提取率的影響Fig.1 Effectofvo

20、lumefractionofethanolsolutiononextractionrateofthetotalflavonoidsfromMenthahaplocalyx2.1.2 料液比對薄荷葉中總黃酮提取率的影響。由圖2可知,料液比在1 20時,可以達到較好的提取效果,繼續增大乙醇用量,總黃酮提取率反而下降,當乙醇用量大于30ml時,總黃酮提取率變化甚微。在實際操作中,當溶劑用量過小時,提取液偏少,不利于過濾分離;當溶劑用量過大時,耗能過多,會增加成本。故料液比以1 20為宜。2.1.3 超聲波功率對薄荷葉中總黃酮提取率的影響。由圖3可知,當超聲波功率400W時,薄荷葉中總黃酮提取率隨著超

21、聲波功率增大而增加,當超聲波功率為400W時,提取率最大;但是當超聲功率>400W時,薄荷葉總黃酮提取率隨著超聲波功率增大而減少。這是因為超聲波功率的增大會增加細胞的破碎程度,從而增加總黃酮的溶出量,但是超38卷34期 邱賀媛等 薄荷葉中黃酮類物質的提取及其抗氧化活性研究19337過一定的功率,產生的空化效應會增強,不利于總黃酮的溶出。故超聲波功率以400W為宜。2.3 薄荷葉提取液對 OH的清除作用2.3.1 水提取液對 OH的清除作用。由圖5可知,相同條件下提取的黃酮類化合物,對 OH的清除率隨著用量的增大而增大,最高清除率達到44.23%。2.3.2 乙醇提取液對 OH的清除作用。

22、由圖6可知,40%乙醇提取液對 OH的清除率隨著黃酮類化合物用量的增加先緩慢上升后持續快速下降。這可能是因為乙醇中醇羥基的存在影響了黃酮對 OH的清除,所以隨著乙醇用量的增加,雖然黃酮含量增加了,但對 OH的清除率卻減小了。表2 L9(3)正交試驗結果Table2L9(3)orthogonaltestresult44圖2 料液比對薄荷葉總黃酮提取率的影響Fig.2 Effectofsolid-liquidratioonextractionrateofthetotalflavonoidsfromMenthahaplocalyx試驗號Testcode234567891k2k3RA112223334

23、.5.5.0.B231231234.5.5.0.C232313125.5.5.0.D233122315.5.5.0.總黃酮提取含量mg/g率%ContentofExtractiontotalflavonoidsrate51.395.0446.514.6349.974.9655.525.4657.595.6850.915.0758.335.7860.125.8416271214623756947343387021280523圖3 超聲波功率對薄荷葉總黃酮提取率的影響Fig.3 Effectofultrasonicpoweronextractionrateofthetotalflavonoidsf

24、romMenthahaplocalyx2.1.4 提取時間對薄荷葉中總黃酮提取率的影響。由圖4可知,提取時間為1040min時,隨著提取時間的增加,薄荷葉中總黃酮的提取率逐漸增加,但超過40min后,提取率反而呈下降趨勢。這可能是因為處理時間過長,薄荷葉中蛋白會變性,對黃酮產生吸附作用,從而降低提取率。故提取時間以40min為宜。圖5 薄荷葉水提取液對 OH的清除率Fig.5 Clearancerateof OHbytheaqueousextractsofMenthahaplocalyx圖4 超聲波提取時間對薄荷葉總黃酮提取率的影響Fig.4 Effectofultrasonicextract

25、iontimeonextractionrateofthetotalflavonoidsfromMenthahaplocalyx2.2 正交試驗結果 由表2可知,各因素對薄荷葉中總黃酮提取率的影響表現為 料液比(A)>超聲波功率(B)>提取時間(C)>乙醇體積分數(D),最佳組合為A3B2C2D2,即薄荷葉中總黃酮提取的最佳工藝條件為:料液比1 30,超聲波功率400W,提取溫度50!,提取時間40min,乙醇體積分數40%。在此優化條件下,測得薄荷葉中總黃酮的含量為.g,6.圖6 薄荷葉乙醇提取液對 OH的清除率Fig.6 Clearancerateof OHbytheeth

26、anolextractsofMenthahaplocalyx3 結論與討論3.1 薄荷葉中總黃酮提取工藝的優化 該研究結果表明,利(下轉第19340頁)19340安徽農業科學 2010年-表2 甘露醇與蘆丁及蘆丁脂肪酸酯對O2 的清除作用Table2 Effectofmannito,lrutinandrutinfattyacidestertoscavengeO-2參考文獻1何銘清.中草藥有效成分理化與藥理特性M.長沙:湖南科學技術出版社,1979:2031.2吳莉宇,彭黎旭,湯建彪.黃酮類化合物的結構理化性質及分布J.熱帶農業科學,1998(5):73-79.3賈承勝,張莎,董濤,等. 谷甾醇

27、/菜油甾醇與月桂酸酯化反應動力學研究J.食品與機械,2009,25(1):7-10.4段煜,杜宗良,唐衛文,等.硬脂酸和月桂酸在Novozym435催化下對蘆丁酯化及分子篩對酯化率的影響J.天然產物研究與開發,2006,18(5):741-746.5李貴榮.枸杞多糖的提取及其對活性氧自由基的清除作用J.中國現代應用藥學雜志,2002,19(2):94.6靳菊情,邊曉麗,葛萍,等.黑石耳多糖對氧自由基及脂質過氧化的影響J.中藥材,2001,24(9):660.7李平,王艷輝,馬潤宇.山茱萸多糖PFCAIII的理化性質及生物活性研究J.中國藥學雜志,2003,38(8):583.8董曉寧,趙強,王

28、俊峰.槐花中蘆丁的正交提取工藝及抗氧化活性研究J.畜牧與飼料科學,2010,31(2):11-13.9HUANGDM,CHANGWZ,DUGJ,eta.lStudyonanti-oxidationandinhibitoryeffectonnonenzymaticglycationreactionoffermentationextractfrombiotransformationofGinkgobilobaL.(EGB)byhericiumerinaceusJ.AgriculturalScience&Technology,2008,9(2):10-13.10黃玉邦,孫永武,周進勤,等.有

29、機硒對羔羊生長性能及抗氧化能力的影響J.畜牧與飼料科學,2009,30(9):22-24.11LIYY.StudyonantioxidantsandlipidperoxidationfrompeacropsofplateanJ.AgriculturalScience&Technology,2009,10(4):19-21.12崔明勛,宋光宇,姜成哲,等.紅曲霉復合制劑對小鼠肝和腎抗氧化能力的影響J.畜牧與飼料科學,2009,30(9):12-13.13WANGS,WEIFJ,CAIYP,eta.lAnti-oxidationactivityinvitroofpolysaccharide

30、sofDendrobiumhuoshanenseandDendrobiummoniliformeJ.AgriculturalScience&Technology,2009,10(6):121-124.試液Testsolution甘露醇Mannitol蘆丁Rutin蘆丁脂肪酸酯Fattyacidester體系濃度mg/mlConcentration1.604.006.400.601.502.400.200.701.0014.39.61.22.53.82.6.24.35.E%63+0.86+0.77+0.36+1.62+0.98+1.47+0.69+1.87+0.9648736082789

31、1534889408394950mg/ml5.13001.42301.35803 結論與討論-該研究結果表明,蘆丁及蘆丁脂肪酸酯對 OH和O2 均具有一定的清除能力,其對 OH的EC50分別為1.7110和0.8933mg/m,l對O2 的EC50分別為1.4230和1.3580-mg/m;l同樣條件下,甘露醇對 OH和O2 的EC50分別為-5.238和5.1300mg/ml。蘆丁脂肪酸酯能有效地清除 OH-和O2 ,并且其清除能力較甘露醇和蘆丁強。這說明蘆丁經過酯化反應后生成的蘆丁脂肪酸酯的抗氧化能力較蘆丁更強,達到了試驗預期的效果。蘆丁脂肪酸酯可作為更好的抗氧化劑加以利用,為降低自由基對

32、人體的危害作出貢獻。(上接第19337頁)用超聲波協同乙醇提取薄荷葉中黃酮類物質的方法是可行的,得到的最佳提取工藝參數為:乙醇體積分數40%,料液比1 30,提取溫度50!,超聲波功率400W,提取時間40min。在此優化條件下,提取得到薄荷葉中總黃酮的含量為65.81mg/g,提取率為6.58%。這遠高于半邊旗(3.13%)98的能力,加之薄荷葉既可以生食,也可以干制,可以滿足人們日益增長地對綠色抗衰老食品的需求,因此薄荷資源具有較大的開發利用價值和廣闊的應用前景。參考文獻1侯敏,馬秀敏,丁劍冰.唇形科植物抗炎、抗過敏和抗氧化活性研究進展J.科技導報,2009,27(4):99-101.2梁

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