神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究_第1頁
神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究_第2頁
神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究_第3頁
全文預覽已結束

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內容提供方,若內容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究                   作者:張立峰,茅祖斌,蔣贊利     【摘要】  目的:探索利用MR技術活體追蹤干細胞的可行性及神經干細胞(NSCs)移植對大鼠脊髓損傷(SCI)后功能恢復的影響。方法:66只SD大鼠隨機分為假損傷組(A組)、SCI對照組(B組)和細胞移植治療組(C組)3組,應用已包被多聚左旋賴氨酸(P

2、LL)的SPIO標記NSCs,對標記細胞進行普魯士藍染色,分別在細胞移植后第1、2、3、4、5周對各組動物進行BBB評分,細胞移植后1、3、5周行MRI檢查。結果:(1)普魯士藍染色證實該方法標記NSCs的有效率為100%。(2)細胞移植后15周,B、C組動物運動功能均有不同程度恢復,但B組恢復較慢,BBB評分差異有統計學意義(P0.05)。(3)1.5 T MRI 檢查 見移植處在T2WI序列呈低信號改變,第3周時低信號向損傷區擴大,第5周時可在損傷區見到低信號改變。結論:MR技術可以活體追蹤干細胞,NSCs移植治療SCI有利于大鼠后肢功能的恢復。 【關鍵詞】  脊髓損傷; 神經干

3、細胞移植; 磁共振成像; 大鼠    脊髓損傷(spinal cord injury,SCI) 后自身的修復能力非常有限,死亡的神經元不能由自身產生的神經元或鄰近的神經元來代替。近年來神經干細胞(neural stem cells,NSCs)的研究改變了這一觀點。NSCs是中樞神經系統中具有增殖和分化能力的一類細胞,是神經系統發育早期特定的細胞群體,它具備干細胞共有的特點,即能長久地保持增殖和分化能力1。隨著分子影像學的發展,干細胞移植后的體內活體追蹤是近期研究的一個突破點2。本研究利用超順磁性氧化鐵(super paramagnetic iron oxide,S

4、PIO) 標記NSCs,對SCI大鼠進行細胞移植后的活體追蹤,探索利用MR技術活體追蹤干細胞的可行性以及NSCs移植對SCI大鼠后肢功能恢復的影響。    1  材料與方法    1.1  胎鼠來源NSCs的制備、培養與鑒定3    取胚齡14 d SD大鼠胚胎的大腦腦室下區組織并吹打成單個細胞,以1×105ml1種瓶,用DMEM/F12(11)無血清培養基內含bFGF 20 ng·ml1、EGF 20 ng·ml1、B27 20 ng·ml1培

5、養。每67 d換液、傳代1次。    對第2代細胞作免疫組化鑒定:取無血清培養基貼壁分化培養24 h的蓋玻片1張,4%多聚甲醛固定30 min。0.25% Triton- 100破膜12 min,然后用5%脫脂奶粉封閉特異性抗原,室溫孵育30 min,吸干殘液滴加1500小鼠抗大鼠nestin IgG1(一抗),4 孵育過夜。第2天滴加FITC標記的羊抗小鼠IgG1二抗,室溫孵育1 h,然后50%緩沖甘油封氣,熒光顯微鏡下觀察并攝像。    1.2  NSCs的標記和染色    細胞傳至第3代,

6、取適量已包被多聚左旋賴氨酸(poly-L-lysine,PLL)的SPIO加入10 ml DMEM/F12培養基中,37 振蕩60 min,使SPIO終濃度為25 g·ml1,將消化的細胞沉淀加入含SPIO的培養基中孵育12 h完成標記。    NSCs標記后普魯士藍染色:標記后的NSCs換成含10血清的DMEM/F12培養液,置6孔板中培養7 d,去掉培養液,PBS洗滌3遍,4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌3遍,含2亞鐵氰化鉀的6鹽酸溶液常溫孵育30 min,顯微鏡下觀察。    1.3  實驗動物分組與

7、SCI模型的制作    66只成年雄性SD大鼠,體重250300 g,隨機分為假損傷組(A組,6只)、SCI對照組(B組,30只)及細胞移植治療組(C組,30只)3組。B、C兩組參照改良的Allen重物打擊法4制作大鼠脊髓背側損傷模型:實驗前大鼠禁食8 h,用戊巴比妥鈉(30 g·L1)按40 mg·kg1腹腔注射麻醉,背部脫毛后俯臥位固定于動物手術臺上,常規消毒,腰背部正中切口,逐層分開顯露T8T10椎板,行T9全椎板切除,顯露硬脊膜,鉗夾固定T8及T10棘突,用10.0    g的不銹鋼棒(直徑為2.5 mm)

8、沿帶有刻度的玻璃導管從25 mm高處垂直下落,打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為3 mm的撞桿上,后者將打擊力傳遞給脊髓,造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合。模型成功的判斷標準:打擊后損傷處脊髓出血、水腫,大鼠出現擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動,麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。A組僅行T9全椎板切除術作對照。術后即刻腹腔注射5%葡萄糖鹽水2 ml,以補充血容量。予青霉素鈉鹽5萬U背外側肌群肌肉注射預防感染,每天1次,持續3 d。注意保溫,分籠飼養,自由取食,每天8:00及20:00行膀胱按摩協助排尿,直至建立反射性排尿。    1.4&#

9、160; 細胞移植    將第3代懸浮培養的NSCs懸液用臺式離心機離心5 min(1 000 r·min1),將細胞團以少量培養液吹勻,細胞計數為105l1。C組動物SCI后9 d于損傷節段下0.5 cm處用5 l微量注射器以與脊髓水平面呈30°角刺入脊髓組織中,注入2 l NSCs懸液,逐層縫合切口。    1.5  運動功能評分    BBB評分5為總分21分的運動功能評分,考察大鼠后肢的運動、軀干的位置和穩定性、步態、協調性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置,表示SCI后

10、大鼠后肢運動功能恢復的過程。BBB評分簡單直觀,易于掌握,與脊髓功能恢復有極好的一致性。分別在動物移植前第7天和移植后1、2、3、4、5周進行盲法BBB評分,由兩名熟悉BBB評分標準的非實驗人員觀察。將動物置于直徑1 m的平面光滑場地自由活動5 min,記錄動物后肢運動情況。    1.6  MR檢查    于術后第1、3、5周分別行MR檢查,掃描序列為T2WI。麻醉方法同前。    1.7  統計學處理    所有數據以x-±s表示,采用SPS

11、S 12.0統計軟件處理,組間比較采用t 檢驗,P0.05表示差異有統計學意義。    2  結    果    2.1  NSCs的培養和鑒定情況    圖1  培養7d時NSCs于無血清培養基中    形成的神經球  ×200    2.2  普魯士藍染色結果    顯示100的NSCs胞質內有細小的藍色氧化鐵顆粒(圖3,見封二)。    2.3  運動功能評分 

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網頁內容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經權益所有人同意不得將文件中的內容挪作商業或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內容的表現方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內容,請與我們聯系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

評論

0/150

提交評論