1、中國農業科學 2010,43(22: Scientia Agricultura Sinica收稿日期:2010-04-06; 接受日期:2010-06-04 基金項目:國家自然科學基金項目(30901006 、國家轉基因生物新品種培育重大專項(2009ZX08011-015B 、江蘇省科技項目(BE2009699,BZ2008119, BZ2009098作者簡介:徐劍宏,副研究員,博士。 Tel E-mail :xjh。通信作者史建榮,研究員,博士。 Tel E-mail :shiji脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌的分離和鑒定徐劍宏,祭 芳

2、,王宏杰,王建偉,林凡云,史建榮(農業部食品質量安全監控重點開放實驗室 /江蘇省農業科學院江蘇省食品質量安全重點實驗室 南京 210014摘要:【目的】分離篩選能夠降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON的細菌,以期能在該毒素的生物解毒處理中 得到應用。 【方法】用高產毒禾谷鐮刀菌 F-25接種滅菌的小麥籽粒,培養后獲得 DON 毒素;然后以 DON 毒素為唯 一碳源進行 DON 毒素降解菌的馴化富集培養,得到能夠降解 DON 毒素的混合菌群,逐一對分離到的細菌進行 DON 毒素降解能力檢測,得到能夠降解 DON 毒素的菌株。【結果】篩選得到的菌株 DDS-1對液體培養基中的 DON 毒素 的降解能力達

3、 95%以上,顯著高于其它菌株;從形態、生理生化特性以及 16S rDNA序列進行分析,DDS-1菌株初 步鑒定為 徳 沃斯氏菌 Devosia sp.;把 DDS-1添加到小麥飼料中后,飼料中的 DON 毒素降解率達到 75.47%。【結 論】選出的 DON 高效降解菌株 徳 沃斯氏菌,不但對液體培養基中的 DON 毒素具有很好的降解作用,對飼料中 DON 毒素也有很好的降解效果。這為真菌毒素的生物脫毒處理提供了可行的方法。關鍵詞:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;降解; 徳 沃斯氏菌;生物解毒Isolation and Identification of Deoxynivalenol Degradati

4、on StrainsXU Jian-hong, JI Fang, WANG Hong-jie, WANG Jian-wei, LIN Fan-yun, SHI Jian-rong(Key Lab of Agro-Food Safety and Quality, Ministry of Agriculture/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province, JiangsuAcademy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014Abstract :【 Objective 】 The aim of

5、 this study was mainly to find bacteria to degrade deoxynivalenol (DON and realize the application of biodetoxification of DON. 【 Method 】 Wheat was inoculated with a high-yielding strain F. graminearum F-25 for the production of DON, and using DON as the only carbon source for enrichment and isolat

6、ion of the mixed culture, then screening for the strains which can degrade DON. 【 Result 】 The strain DDS-1 was screened out from 1 000 strains, the degradation ratio of DON reached more than 95%, which was obviously higher than others. According to its morphological, physiological, and biochemical

7、characteristics and 16S rDNA gene sequence, the strain DDS-1 was finally identified as Devosia sp. After DDS-1 was added to the feedstuff, the toxin in the feed can be degraded by 75.47%. 【 Conclusion 】 The strain DDS-1 that can degrade DON was identified preliminarily as Devosia sp. DDS-1 can not o

8、nly degrade DON in liquid medium, but also degrade DON in feedstuff. The strain of Devosia sp. can degrade DON, thus supplying a feasible solution for biodetoxification of DON.Key words: deoxynivalenol; degradation; Devosia sp.; biodetoxification0 引言【研究意義】 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇 (DON , 3, 7, 15三羥基 12, 13環氧單端孢霉 -

9、9烯 -8酮是由禾谷 鐮刀菌(Fusarium graminearum產生的重要真菌毒 素 1-2, 該毒素不僅能加重赤霉病的病情, 影響谷物的產量和質量,而且對人、畜具有高度危害性,可致動 物嘔吐、腹瀉、流產等 3-6。研究表明 DON 對人和動 物的致毒模式是 DON 毒素干擾了核糖體肽基轉移酶 的作用中心, 阻礙了核糖體循環并抑制其起始反應和 終止反應, 從而抑制蛋白質的合成 7-9。 鑒于 DON 毒素危害的嚴重性, 有必要采取有效可行的方法控制谷中 國 農 業 科 學 43卷物中毒素的含量。 由于微生物資源豐富, 自然界中總 能找到能夠去除和降解毒素的微生物。 和其它方法相 比, 采

10、用微生物方法去除毒素條件相對溫和, 不會影 響谷物的品質和營養。因此,開發利用新的微生物資 源來進行 DON 毒素的生物脫毒具有重要的意義和前 景 10-12。【前人研究進展】 Fuchs 等 13從牛瘤胃的富 集 培 養 物 中 分 離 到 一 株 厭 氧 優 桿 菌 屬 細 菌 (Eubacterium BBSH797,該菌可以在 24 48 h轉 化 DON 和其它單端孢霉烯族毒素,從而部分地減輕 飼料中毒素的毒性; Shima 等 14從土壤中分離到一株 屬于土壤桿菌 根瘤菌屬的細菌, 該菌能夠把 DON 轉化為 3-酮基 -DON , 從而減少 DON 在免疫抑制方面 的毒性; He

11、 等 15分離到一株能夠氧化 DON 毒素的塔 賓曲霉(Aspergillus tubingensis NJA-1。【本研究切 入點】 DON 對人、 畜具有很高的毒性, 目前有多種方 法處理真菌毒素,包括物理去除法、理化吸附法、化 學分解法等, 但是這些方法不僅效率不高, 費時費力, 且會造成營養成分的損失 16-17。 【擬解決的關鍵問題】 筆者嘗試分離篩選出能夠降解 DON 毒素的降解菌株, 對其進行生物學鑒定,并研究降解菌株的降解特性, 為利用該菌株去除 DON 毒素奠定基礎。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 微生物 禾谷鐮刀菌 F-25是江蘇省農業科學 院食品安全重點實驗室從感染

12、赤霉病的小麥病穗中分 離到的高產毒菌株。 土壤和麥穗樣品為 2005年采自江 蘇省農業科學院小麥試驗地,土壤樣品采自距地表 5 cm 深度,小麥麥穗樣品采自于赤霉病嚴重的麥穗。 1.1.2 培養基 基礎鹽培養基 (MM :K 2HPO 4(2.5 g·L-1, KH 2PO 4(1.2 g·L-1, NH 4NO 3(1.0 g·L-1, MgSO 4·7H2O (0.2 g·L-1 , Ca(NO3 2·4H2O (0.4 g·L-1 , NaCl (0.5 g·L-1, Fe 2(SO4 3(0.001 g&#

13、183;L-1, pH 7.0, 用于毒素降解菌的馴化富集。培養禾谷鐮刀菌的培養 基為 PDA 培養基; 制備 DON 毒素的培養基為麥粒培 養基;分離降解菌的培養基為 LB 培養基。1.2 方法1.2.1 DON粗毒素的的制備 在 PDA 培養基上培養 禾谷鐮刀菌 F-25, 把培養好的 F-25接種于麥粒培養基 上, 28光照培養箱培養 35 d后,參照 Clifford 等 18的方法提取純化 DON 毒素, 制備 DON 毒素的濃度根 據 Sigma 公司的標準 DON 毒素來進行標定。1.2.2 降解 DON 毒素菌株的富集與篩選 把采集來 的土壤和麥穗樣品放置于含有 10 mg&#

14、183;L-1 DON毒素的 MM 培養基中, 30搖床 180 r/min培養 15 d后,按 5%的接種量接種到含有 10 mg·L-1DON 毒素的 MM 新鮮培養基中, 按上述同樣操作多次接種培養后, 取 培養液加入相同體積的色譜純甲醇, 超聲混勻過有機 相針頭過濾器后,按下面 1.2.4中的方法檢測富集液 對 DON 毒素的降解情況;把有降解功能的富集液涂 布于 LB 培養基平板上, 30恒溫培養箱培養 48 h后,挑取不同的單菌落,首先接種于 LB 培養基中, 在 30搖床 180 r/min培養 48 h, 10 000 r/min室溫 下離心 5 min后,棄上清后重

15、懸于等體積的 pH 7.0的 磷 酸 緩 沖 液 中 , 按 5%的 接 種 量 接 種 到 含 有 10 mg·L-1 DON毒素的 MM 培養基中,以不加菌的 pH 7.0的磷酸緩沖液按同量比例接種于相同濃度 DON 毒素的 MM 培養基作為對照,在 30搖床 180 r/min培養 48 h后,取培養液加入相同體積的色譜純 甲醇, 超聲混勻后過有機相針頭過濾器后, 用高效液 相色譜檢測培養液中的 DON 毒素含量,通過和對照 進行 DON 含量的比較,獲得具有降解 DON 功能的 單菌株。1.2.3 菌株的鑒定 (1 形態鑒定 把降解菌接種到 TSA 培養基平板上, 30

16、76;C培養 48 h后,用日立 -7650 透射顯微鏡觀察菌體的形態; (2 生理生化鑒定由中 國工業微生物菌種保藏管理中心進行鑒定 19-20;(3 細菌 16S rDNA 基因序列測定 基因組 DNA 的提 取 采用高鹽法提取降解菌的基因組 DNA 21; 16S rRNA 序列的 PCR 反應引物:27f :5 -AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3 ; 1492R :5 -TACCTTGTTACGACTT -3 ;測序。由上海生工生物工程技術有限公司純化 和測序。序列的數據處理 測序結果在 NCBI 使用 Blast 比對,從 GenBank 數據庫中獲得與菌株 16S r

17、DNA 源的公認標準序列數據,使用 Clustal X 1.8把 不同的序列對齊后,使用 DNAman5.1 構建菌株的系 統進化樹。1.2.4 DON毒素的檢測 (1高效液相色譜檢測參 照文獻 22-23作部分改進, 具體條件為:安捷倫 Zorbax SB-C18柱 (4.6 mm×250 mm, 5 µm ; 進樣量:20 µL ; 流動相 :乙腈 :水(10 90 v/v;流速:1.0 mL·min-1; 檢測波長:218 nm; (2 HPLC-MS 檢測參照文獻 24-25作部分改進, 具體條件為:安捷倫 1200 系列 LC/MS, 四極桿質

18、譜系統, ESI 正離子模式。 安捷倫 Zorbax SB-C18 柱(2.1 mm×150 mm, 3.5 µm,進樣量:5 µL ;流動相:甲醇水正丁酸(10 90 0.1, v 22期 徐劍宏等:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌的分離和鑒定v v ; 流速:0.4 mL·min-1; 干燥氮氣流速:10 L·min-1霧化器:25 psi;干燥氣溫度:350°C,毛細管電壓:4 kV 。1.2.5 DDS-1對飼料中 DON 毒素的降解 稱取連云港 正大公司生產的豬飼料 450 g,添加 DON 毒素,使其 終濃度為 25 mg

19、3;L-1,拌勻后,平均分成 9份,做 3種 不同的處理, 每個處理設 3個重復, 第一種加入 50 mL無菌水(空白,第二種加入 50 mL滅過菌的 LB 培 養液 (對照 , 第三種加入含有細胞濃度為 106cells/mL的 DDS-1培養液 50 mL(處理 , 然后都放入 30培 養箱處理 48 h后,按照 Clifford 等 18的方法提取各 個處理樣品中 DON 毒素并用高效液相色譜法檢測各 個不同處理中 DON 毒素的含量。2 結果2.1 DON毒素降解菌株的初篩以 DON 毒素為選擇壓力, 按 1.2.2的方法對采集 到的樣品進行富集馴化培養,得到 2組對 DON 具有 降

20、解功能的富集液,這 2組富集液對 DON 的降解能 力分別達到 70%和 95%以上,在 LB 平板上對這兩組 富集液進行涂布培養, 再按 1.2.2的方法對平板上生長 出來的菌落一一進行 DON 降解功能的檢測,最終得 到 3株對 DON 毒素具有降解能力的菌株 DDS-1、 DDS-2、 DDS-3, 它們對 DON 毒素的降解率分別達到 95%、 85%、 72%以上, 選擇降解能力最好的菌株 DDS-1進行深入研究。2.2 DDS-1對 DON 毒素的降解高效液相色譜法檢測 DDS-1對 DON 毒素的降解, 檢測結果見圖 1。 同時在 DON 毒素降解過程的不同的 時間取樣, 每次取

21、樣 1 mL, 用 5倍體積的乙酸乙酯經 3次提取,吸取乙酸乙酯層,合并乙酸乙酯后旋轉蒸 干用色譜純甲醇重新溶解,過有機相針頭濾器后,用 液質連用定量檢測培養液中 DON 的含量,結果見圖 2。檢測結果表明, DON 毒素在 DDS-1的作用下, 48 h 后, 已基本檢測不到 DON 毒素的存在, 表明 DDS-1對 DON 毒素有很好的降解功能,但是具體降解成什 么產物,降解產物有沒有毒性,還有待下一步深入研 究。 圖 1 DDS-1對 DON 毒素降解的液相色譜圖Fig. 1 HPLC chromatograms of degradation of DON by DDS-12.3 DON

22、毒素降解菌株 DDS-1的鑒定DDS-1在 TSA 培養基上菌落呈象牙色(圖 3, 好氧,顯微鏡下的形態為細小短桿菌,革蘭氏染色 陰性,通過電子顯微鏡觀察, DDS-1為單生鞭毛(圖 4。DDS-1生理生化特征:能利用葡萄糖,不能利用 L-阿拉伯糖、 D-甘露糖、麥芽糖;不能水解酪素、淀 粉、精氨酸、酪氨酸等(表。參照常見細菌系統鑒 定手冊以及伯杰氏細菌鑒定手冊等并結合對 DDS-1菌株的細胞形態觀察,初步確定該菌為德沃斯氏菌 屬 19-20。將 DDS-1的 16S rDNA基因序列在 NCBI 使 用 Blast 比對,從 GenBank 數據庫中獲得相關的標準 序列數據進行系統發育分析。

23、由圖 5可知, DDS-1與 D. insulae (EF012357位于同一個分支上 26-27,同源 性達到 99%,結合遺傳距離、形態特征以及生理生化 特征,可以把 DDS-1初步確定為德沃斯氏菌屬。 2.4 DDS-1對飼料中 DON 毒素的降解提取各個樣品中 DON 毒素并用 HPLC 檢測不同 處理中 DON 毒素的含量 (圖 6 , 結果顯示空白樣品 和對照樣品中 DON 毒素穩定存在,沒有被降解;而 加入降解菌 DDS-1處理的樣品中 DON 毒素的含量明 顯減少,降解效率可以達到 75.47%。22期 徐劍宏等:脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解菌的分離和鑒定 圖 2 DDS-1對 DO

24、N 毒素降解的定量質譜圖Fig. 2 LC-MS chromatograms of degradation curve of DON by DDS-1表 DDS-1的生理生化特性Table Physiological characteristics of DDS-1項目 Experiment item結果Result項目Experiment item結果Result結果 Result接觸酶 Catalase + 尿酶 Urease + Antigentamgcin -運動性 Motility + 精氨酸雙水解 Arginine double- hydrolyzation-Antiampicil

25、lin + 吲哚反應 Indole reaction -明膠液化 Gelatin hydrolyzation -Antichloramphenicol + 酪素水解 Tyrosine hydrolyzation -酪氨酸分解 Tyrosine decomposition -Antitetracycline + 氧化酶 Oxidase -葡萄糖利用 Glucose utilization + Spore -七葉靈水解 Polychrom hydrolyzation +W 阿拉伯糖利用 L-arabinose utilization -Gram stain reaction -硝酸鹽還原 Nitr

26、ate reduction -甘露糖利用 D-mannitose utilization- Cell shape 短桿狀short rod淀粉水解 Starch hydrolyzation -麥芽糖利用 Maltose utilization - Flagellum +“+” 為陽性; “-” 為陰性; “+w ” 為弱陽性 “+” means positive; “-” means negative; “+w ” means weak positive3 討論脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是小麥等谷物受赤霉病菌侵 染后產生的一種主要真菌毒素。迄今為止,已有一些 利用微生物去除真菌毒素污染的報道。本研究采

27、用 DON 毒素多代馴化富集采集的樣品, 成功獲得了能夠 降解 DON 毒素的富集液,進一步通過平板涂布,篩 選獲得了能夠降解 DON 毒素的 3株降解菌。選取降解效果最好的降解菌 DDS-1進行深入研 究。液相色譜和液質連用方法檢測表明,當把 DDS-1按 5%接種量接種到含有 10 mg ·L-1DON 毒素的 MM 培 養基中, 30搖床中 180 r/min培養 48 h后,已經檢 測不到 DON 毒素。通過對 DDS-1的生理生化特性和 16S rDNA序列鑒定, DDS-1被初步確定為德沃斯氏 菌屬,且德沃斯氏菌屬具有降解真菌毒素 DON 的功 能。 通過 DDS-1對小

28、鼠的急性毒性試驗 (委托南京醫 科大學衛生分析檢測中心進行,證明該菌株本身 是安全的(具體試驗結果沒有在本文中列出;當把中 國 農 業 科 學 43卷 圖 3 TSA平板上的 DDS-1菌落Fig. 3 The colony of strain DDS-1 on TSA plate 圖 4 DDS-1的電鏡照片Fig. 4 Electronic photograph of strain DDS-1 圖 5 DDS-1菌株的系統發育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of strain DDS-1 圖 6 DDS-1對飼料中 DON 毒素的降解Fig. 6Degradation

29、of DON in feed by DDS-1DDS-1添加到飼料中后, 30條件下在 48 h內可以降 解 75.47%的 DON 毒素。 今后將要對 DDS-1降解 DON 毒素的過程進行深入研究,首先在降解過程的不同時 間收集、分離純化 DON 毒素的降解產物,通過質譜、 紅外光譜及核磁共振等多種方法確定降解產物的結 構,推導出 DDS-1對 DON 的降解途徑,并且明確降 解產物的毒理特性。如果能確定降解產物是安全的, 或者是毒性要比原有的 DON 毒素低得多,就有可能 把降解菌 DDS-1開發成真菌毒素去毒劑, 這將對減輕 DON 毒素對畜牧業的影響, 保護人類的身體健康起到 重要的

30、作用。4 結論以 DON 毒素為唯一碳源和能源進行初篩,復篩 DON 毒素降解菌, 通過液相色譜和液質連用的方法檢 測了降解菌對 DON 毒素的降解情況,并最終獲得能 夠高效降解 DON 毒素的降解菌 DDS-1;通過分析其 形態特征、生理生化特征、系統發育等, DDS-1被初 步確定為德沃斯氏菌屬;培養液和飼料中的 DON 毒 素都可以被 DDS-1降解,通過對小鼠的急性毒性試 驗,證明 DDS-1本身是安全的; DDS-1可否用作去 除 DON 毒素的飼料添加劑還要看 DDS-1對 DON 毒 素的具體降解途徑、降解產物的安全性以及其它用作 飼料添加劑必須要滿足的技術參數等。Referen

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