1、1PCR技術在醫學領域的應用 2 聚合酶鏈反應或多聚酶鏈反(Polymerase Chain Reaction, PCR）又稱無細胞克隆技術(“free bacteria”cloning technique) 特定的DNA片段在體外進行快速擴增的新方法。 在數小時內可使幾個拷貝的模板序列甚至一個DNA分子擴增107108倍，大大提高了DNA的得率。3 PCR技術最早由美國Cetus公司人類遺傳研究室Kary Mullis及同事于1985年發現并研制成功的； 最早的應用報道是Saiki等1985年將PCR技術應用于-珠蛋白基因擴增和鐮刀狀紅細胞貧血的產前診斷。 使用1976年Chien等分離的熱

2、穩定性Taq DNA聚合酶，使PCR操作大為簡化，并使PCR自動化成為可能； 1987年Kary Mullis等完成了自動化操作裝置，使PCR技術進行實用階段。 4 PCR已獲得廣泛應用,目前，每年都有上千篇文章發表。 1991年，期刊“PCR方法與應用”（PCR Methods and Application）在美國創刊，使有關學者有了自己的論壇和參考的專業期刊。 Kary Mullis因發明了“聚合酶鏈式反應”而獲得1993年度諾貝爾化學獎。(一名加拿大籍英國科學家Michael Smith因開創了“寡核苷酸基因定點誘變”的方法而與Mullis同享此榮)5PCR技術檢測細菌 鴨疫里默氏桿菌

3、 霍亂弧菌 食源性病原細菌 結核桿菌6PCR與病毒類疾病應用 雜交法檢測植物病毒和類病毒 利用RT-PCR對黃瓜病毒源種類進行檢測 診斷人類乳頭狀病毒HPV感染7診斷遺傳疾病8PCR的特點 特異性高-聚合酶 首次報導用大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段。90會變性失活，需每次PCR循環都要重新加入；同時引物是在37延伸 Taq DNA聚合酶 1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩定的，擴增過程中，單核苷酸的錯誤參入程度很低、其錯配率一般只有約萬分之一9 高度敏感： 理論上PCR可以按2n倍數擴增DNA十億倍以上。 應用證實可以將極微量的靶DN

4、A成百萬倍以上地擴增到足夠檢測分析量的DNA。 能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞，或對諸如病人口液等只含一個感染細胞的標本或僅含0.01pg的感染細胞的特異性片段樣品中均可檢測。 10 快速 簡便 可擴增RNA或cDNA 11試劑 引物：決定擴增的特異性。根據檢測的DNA不同，選用不同引物。 耐熱的DNA聚合酶： 10PCR緩沖液500mmol/lKCl;100mmol/L Tris-HCl(pH8.4,20)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明膠。 dNTP貯備液 DNA模板 12操作程序 試劑混合 PCR儀程序設計：94變性30s，55退火20s，然后在72延伸30s，共循環3

5、0-35次。最后一次循環結束后，再將反應管置72溫育5min，以確保充分延伸。 13PCR反應基本條件及其對PCR的影響 模板核酸 有機溶劑酚 蛋白質污染 核酸污染 核酸的量 14引 物 引物與PCR的特異性， 引物限定擴增產物的大小。 合成的引物必須經聚丙烯酰胺凝膠電泳或反向高壓液相層析（HPLC）純化。 凍干引物于-20至少保存12-24個月，液體狀態于-20可保存6個月。引物不用時應存于-20保存。 15緩沖液 緩沖液的目的：給Taq DNA聚合酶提供一個最適酶催反應條件。 目前最為常用的緩沖體系為10-50mmol/LTris-HCl (Tris是一種雙極性離子緩沖液，pH變化于6.8

6、-7.8之間。將Tris濃度加大到50mmol/L，pH8.9,有時會增加產量。 50mmol/L以內的KCl，50 mmol/L以上的KCl則抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反應液中以NH+4代K+。 反應中加入小牛血清白蛋白（100g/ml）或明膠（0.01%）或Tween 20（0.05% 0.1%） 5mmol/l 的二硫蘇糖醇（DTT）有助于酶的穩定，尤其在擴增長片段（此時延伸時間長）時。16Mg2+ Mg2+濃度直接影響著酶的活性與忠實性。影響著引物的退火，模板與PCR產物的解鏈溫度引物二聚體的形成等。 Mg2+濃度過低時，酶活力顯著降低；過高時，通常會導致非特異性擴增產物的累

7、積。 Taq DNA聚合酶需要的是游離Mg2+ 。 DNA模板，引物和dNTP 的磷酸基團均可與Mg2+結合，降低Mg2+實際濃度。17三磷酸脫氧核苷酸dNTP dNTP是DNA合成的基本原料。 含量太低，PCR擴增產量太少、易出現假陰性。 dNTP濃度過高會導致其錯誤摻入（即所謂的“熱力背信”）。一般認為最適的dNTP濃度為50200mol/L。 dNTP的質量也直接影響PCR反應的成敗。 18耐熱DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶取代了大腸桿菌DNA聚合酶I大片段使 PCR得到廣泛應用。 Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌Thermus Aquaticus（Taq）中分離出的熱穩定性DNA

8、聚合酶。 Taq DNA聚合酶簡化了PCR程序,增加了PCR特異性及PCR擴增效率。該酶的最適溫度很高（79）， 100l反應液中含1-2.5u Taq DNA聚合酶為佳， Taq DNA聚合酶保存不當而失活是PCR實驗失敗的常見原因。19溫度循環參數 變性溫度與時間 復性溫度與時間 延伸溫度與時間 循環數： 20PCR實驗中常見問題對策 假陰性問題 假陽性問題。 21假陰性 Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制 引物設計不合理 提取的模板質量或數量不過關以及 PCR系統欠妥當 循環次數不夠22假陽性 微量的靶基因污染 標本間的交叉污染 樣品中存在有靶基因的同源序列 PCR操作時要隔離

9、不同操作區、分裝試劑、簡化操作程序，使用一次性吸頭。 23PCR技術的延伸 PCR是一種技術和方法，在使用中不同的人根據自己的試驗目的、結合自己的知識背景、研究、創造了不同的PCR方法，開拓了PCR應用的新領域。現在至少有15種不同的PCR用于不同的試驗。24反轉錄PCR-Reverse transcription PCR一種檢測底豐度特異 的方法 互補靶cDNA生成 雙鏈靶DNA 擴增靶DNA25RTPCR反應體系 PCR的反應體系但是模板是RNA RNA酶抑制劑RNasin 反轉錄酶 禽酶禽類成髓細胞性白血病病毒(Avian myeloblastosis virus,AMV) 鼠酶莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus)26Touch down PCR 一般PCR的體系 一般PCR的設計原理 不同的PCR過程 目的：在不知道理想退火溫度的條件下保證擴出產物27梯度PCR 在特殊PCR儀上進行的一般PCR 目的：尋找最佳的退火溫度 與TouchDown PCR的區別 TD PCR：對同一PCR體系采用不同的退火 溫度進行 PCR循環 梯度PCR：同時對多個PCR體系采用不同的退火溫度進行PCR循環28巢（套）式PCR-nested Primer PCR 不同的PCR體系兩對引物 不同的PCR過程兩段循環 目的：