1、微生物大小及數量的測定、實驗目的：1、學習并掌握使用顯微鏡測微尺測定微生物大小的方法2、掌握對不同形態細菌細胞大小測定的分類學根本要求，增強對微生物細 胞大小的感性認識3、學習并掌握使用血細胞計數板測定微生物細胞或孢子數量的方法二、實驗器材1、菌種：枯草芽孢桿菌、釀酒酵母2、溶液和試劑香柏油、二甲苯、美蘭染液3、儀器和其他用品 目鏡測微尺、鏡臺測微尺、普通光學顯微鏡、擦鏡紙、軟布、血細胞計數 板、凹載玻片、蓋玻片、接種環、酒精燈、試管、吸管、移液槍三、實驗原理1、測微尺： 微生物大小的測定，需要借助于特殊的測量工具顯微測微尺，它包括 目鏡測微尺和鏡臺測微尺兩個互相配合使用的部件。鏡臺測微尺是一

2、個在特制載玻片中央封固的標準刻尺， 其尺度總長為 1mm， 精確分為 10個大格，每個大格又分為是 10個小格，共 100個小格，每個小格長 度為0.01mm，即10卩m。刻線外有一直徑為© 3，粗線為0.1mm的圓，以便調 焦時尋找線條。刻線上還覆蓋有厚度為0.17mm的蓋玻片，可保護刻線久用而不 受損傷。鏡臺測微尺并不直接用來測量細胞的大小，而是用于校正目鏡測微尺 每一格的相對長度。目鏡測微尺是一塊可放入接目鏡內的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻 度，一般有等分為 50 個小格和 100 個小格兩種。測量時，需將其放在接目鏡中 的隔板上， 用以測量經顯微鏡放大后的細胞物象。 由于

3、不同顯微鏡或不同的目鏡 和物鏡組合放大倍數不一樣， 目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實際長度 也不一樣。 因此，用目鏡測微尺測量微生物大小時， 必須先用鏡臺測微尺進行校正，以求出該顯微鏡在一定放大倍數的目鏡和物鏡下， 目鏡測微尺每小格所代表 的相對長度。然后根據微生物細胞相當于目鏡測微尺的格數， 即可計算出細胞的 實際大小。球菌用直徑表示大小，桿菌用長和寬來表示大小適臺測減尺中央罄分) » 20 3 呻咻啊III伽O40904a7DNU«|訓|吋|訕川林1川11 1巾|加| "L| 11丿且慣刪渤尺用鎮臺測微尺校正目覆汕即尸2、顯微鏡計數：顯微鏡計數是將少量待

4、測樣品的懸浮液置于一種特定的具有確定容積的載 玻片上又稱計菌器，于顯微鏡下直接觀察、計數的方法。目前國內外常用的 計菌器有：血細胞計數板、Peteroff-Hauser計菌器以及Hawksley計菌器等，它們 可用于各種微生物單細胞抱子懸液的計數，根本原理相同。其中血細胞計數 板較厚，不能用油鏡，常用于個體相對較大的酵母細胞、霉菌抱子等的計數，而 后兩種計數器澆薄，可擁油鏡對細菌等較小的細胞進行觀察和計數。除了使用上 述這些計菌器外，還有用顆粒濃度的樣品如血液與未知濃度的微生物細胞樣 品混合后根據比例推算后者濃度的比例計數法。顯微鏡計數法的優點是直觀、快 速、操作簡單，缺點那么是所測得的結果通

5、常是死菌體和活菌體的總和，且難以對運動性強的活菌進行計數。目前已有一些方法可以克服這些缺點， 如結合活菌染 色、微室培養以及加細胞分裂抑制劑等方法來到達只計數活菌體的目的，或用染色處理等殺死細胞以計數運動性細菌等。 本實驗以常用的血細胞計數板為例對顯 微計數法的具體操作的具體操作進行介紹。血細胞計數板是一塊特制的載玻片， 其上由4條槽構成3個平臺。中央較寬 的平臺又被一短槽橫隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網 共分成9個大方格，中間的大方格即為計數室。計數室的刻度一般有兩種規格， 一種是一個大方格分為25個中方格，而每個中方格又分為16個小方格；另一種是一個大方格分為16個中

6、方格，而每個中方格又分為25個小方格，但無論哪一種規格的計數板，每一個大方格中的小方格數都是400個。每一個大方格邊長為 1mm，那么每一個大方格的面積為1mm23。計數時，通常數5個中方格的總菌數，然后求得每個中方格的平均值，再乘 以25或16,就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成1ml菌液中的總菌數。以25個中方格的計數板為例，設5個中方格中的總菌數為A，菌液稀釋倍 數為B，那么:1ml菌液中的總菌數=2 5X 25X10% X BO-lOOmm17!mm doacI JV Jk jF血球計數板的構造3 菌種的選取:微生物細胞的大小是微生物根本的形態特征，也是分類鑒定的依據之一。從 分

7、類角度來說， 對不同形態微生物細胞大小的測量有不同的要求。 例如，球菌是 用直徑范圍表示其大小， 桿菌和螺菌那么是用細胞的直徑和長度的范圍來表示， 但 桿菌測量的是細胞的直接長度， 而螺菌測量的是菌體兩端的距離而非細胞實際長 度。一般來說， 同種不同個體的細菌細胞直徑的變化范圍較小， 分類學指標價值 更大，而長度相對來說變化范圍較大。顯微鏡直接計數法適宜對能在液體中均勻分散的微生物細胞或孢子的數量 進行直接計數。 通常使用的血細胞計數板不適合使用油鏡， 因此采用個體較大的 酵母細胞及霉菌孢子作為實驗材料，以保證實驗的觀察效果。四、實驗步驟：1菌體大小的測定：1、目鏡測微尺的安裝： 取出目鏡測微

8、尺，把目鏡上的透鏡旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡 筒內的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插回鏡筒內。雙目顯微鏡的左目鏡通常配有屈光度調節環，不能被取下，因此使用雙目 顯微鏡時目鏡微測尺一班都安裝在右目鏡中。2、校正目鏡測微尺： 將鏡臺測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺上。先用低倍鏡觀察，將鏡臺 測微尺有刻度的局部移至視野中央， 調節焦距，當清晰地看到鏡臺測微尺的刻度 后，轉動目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺測微尺的刻度平行。 利用推進器移動鏡 臺測微尺， 使兩尺在某一區域內兩線完全重合， 然后分別數出兩重合線之間鏡臺 測微尺和目鏡測微尺所占的格數。用同樣的方法換成高倍顯微鏡和油鏡進行校正，分別

9、測出再高倍鏡和油鏡 下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數。由于鏡臺測微尺每格長10卩m，根據以下公示即可分別計算出在不同 放大倍數下，目鏡測微尺每格所代表的的長度。目鏡測微尺每格長度卩m)=兩重合線間鏡臺測微尺格數x 10/兩重合線 間鏡臺測微尺格數3、菌體大小測定：目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺測微尺，換上細菌染色制片。先用低倍 鏡和高倍鏡找到標本后， 換油鏡測定釀酒酵母的直徑和枯草芽孢桿菌的寬度和長 度。測定時， 通過轉動目鏡測微尺和移動載玻片， 測出細菌直徑或寬和長所占目 鏡測微尺的格數。 最后將所測得的格數乘以目鏡測微尺每格所代表的的長度， 即 為該菌的實際大小。值得注意的是， 和動植物

10、一樣， 同一種群中的不同細菌細胞之間也存在個體 差異，因此在測定每一種細菌細胞的大小時應至少隨機選擇 10 個細胞進行測量， 然后計算平均值。4、測定完畢： 測量完畢后取出目鏡測微尺，將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺 測微尺分別用擦鏡紙擦干凈，放回盒內保存。2顯微鏡計數1、菌懸液稀釋：按照實驗所需倍數稀釋菌懸液，本實驗將釀酒酵母稀釋了 20 倍，得到的適 合計數的菌懸液。2、檢查血細胞計數板： 在加樣前，應先對血細胞計數板的計數室進行鏡檢。 假設有污物， 可用自來 水沖洗，再用 95%的乙醇棉球輕輕擦洗，然后用吸水紙吸干或用電吹風吹干。計數板上的計數室的刻度非常精細，清洗時切勿使用刷子等

11、硬物，也不可 用酒精燈火焰烘烤計數板。3、加樣品： 將清潔枯燥的血細胞計數板蓋上蓋玻片， 再用無菌的毛細滴管將搖勻的釀 酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴， 讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計 數室，再用鑷子輕壓蓋玻片， 以免因菌液過多將蓋玻片頂起而改變了計數室的容 積。加樣后靜置5min，使細胞或抱子自然沉降。取樣時先要搖勻菌液，加樣時 計數室不可有氣泡產生。4、顯微鏡計數 ： 將加有樣品的血細胞計數板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍鏡找到計數室 所在位置， 然后換成高倍鏡進行計數。 假設發現菌液太濃或太稀， 需重新調節稀 釋度后再計數。一般樣品稀釋度要求每小格內有 5-10 個菌體為宜。每個計

12、數室 選5個中格可選4個角和中央的1個中格中的菌體進行計數。位于格線上的 菌體一般只數上方或右邊線上的。如遇酵母出芽，芽體大小到達母細胞的一半時， 即作為兩個菌體計數。計數一個樣品要從兩個計數室中計得的平均數值來計算樣 品的含菌量。5、清洗:使用完畢后，將血細胞計數板及蓋玻片按前面介紹的程序進行清洗、枯燥， 放回盒中，以備下次使用。五、實驗結果：1、目鏡測微尺的標定結果:物鏡物鏡倍數目鏡測微尺格數鏡臺測微尺格數目鏡測微尺每格代表的長度/卩m低倍鏡105510高倍鏡4045112.4油鏡1001112、微生物大小的測定酵母菌大小的測定組別123平均值長度卩m枯草芽抱桿菌大小測定組別123平均值寬

13、度卩m0.80.7長度卩m3、酵母菌數量的測定稀釋20倍，計數板25中格*16小格實驗次數各中格中菌數總菌數稀釋倍數平均值菌數個/mL145231六、實驗小結：實驗成功應注意的事項有：1 、微生物大小測定時，觀察時光線不宜過強，否那么難以找到鏡臺測微尺的 刻度；換高倍鏡和油鏡校正時，務必十分細心，防止接物鏡壓壞鏡臺測微尺和損 壞鏡頭。2、使用鏡臺測微尺進行校正時，假設一時無法直接找到測微尺，可先對刻尺 外的圓圈線進行準焦后再通過移動標本推進器進行尋找。3 、細菌個體微小，在進行細胞大小測定時一班應盡量使用油鏡， 以減少誤差。4、細菌在不同的生長時期細胞大小有時會有較大變化，假設需自己制樣進行細

14、胞大小測定時，應注意選擇處于對數生長期的菌體細胞材料。5 、活細胞是透明的，因此在進行顯微計數或懸滴法觀察時均應適當減低視野 寬度，以增大反差。6、進行顯微技術時應先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計數室后將其移 至視野中央，再換高倍鏡觀察和計數。七、思考題：1 為什么更換不同放大倍數的目鏡或物鏡時，必須用鏡臺測微尺重新對目鏡測 微尺進行校正？答：由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數不相同，目鏡測微尺每格實際表示 的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測 微尺校正，以求出在一定放大倍數下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。 2在不改變目鏡和目鏡測微尺，而改用不同放大倍數的物鏡來測定同一細菌的 大小時，其測定結果是否相同？為什么？答：不相同，不同放大倍數下測量的精度不同。3結合你的實