1、 第一章第一章 菌種選育菌種選育 第一節第一節 工業常用微生物及要求工業常用微生物及要求一、常見微生物一、常見微生物 （一）細菌（一）細菌（bacteriabacteria） 醋桿菌屬（醋桿菌屬（AcetobacterAcetobacter） 乳桿菌屬（乳桿菌屬（LactobacillusLactobacillus） 芽孢桿菌屬（芽孢桿菌屬（BacillusBacillus） 短桿菌屬（短桿菌屬（BrevibacteriumBrevibacterium） 棒桿菌屬（棒桿菌屬（CorynebacteriumCorynebacterium）（二）放線菌（二）放線菌（actinomycesactin

2、omyces）最大的經濟價值在于產生多種抗生素最大的經濟價值在于產生多種抗生素（antibioticantibiotic） 鏈霉菌（鏈霉菌（StreptomycesStreptomyces） 小單孢菌屬（小單孢菌屬（MicromonosporaMicromonospora） （三）霉菌（三）霉菌（mouldmould） 1.1.曲霉屬（曲霉屬（AspergillusAspergillus） 黑曲霉（黑曲霉（A. nigerA. niger） 米曲霉（米曲霉（A. oryzaeA. oryzae） 黃曲霉（黃曲霉（A. flavusA. flavus） 2.2.青霉屬（青霉屬（Penicillu

3、mPenicillum） 桔青霉（桔青霉（P. citrinumP. citrinum）產生產生5 5磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個單核苷酸。磷酸二酯酶，降解核糖核酸為四個單核苷酸。3. 3. 根霉屬（根霉屬（RhizopusRhizopus ） 米根霉（米根霉（R. oryzaeR. oryzae） 華根霉（華根霉（R. chinensisR. chinensis）4. 4. 紅曲霉屬（紅曲霉屬（MonascusMonascus）（四）酵母（四）酵母（yeastyeast） 酵母屬（酵母屬（SaccharomycesSaccharomyces） 啤酒酵母（啤酒酵母（Saccharomyces

4、 cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae）2. 2. 假絲酵母屬（假絲酵母屬（CandidaCandida） 產朊假絲酵母（產朊假絲酵母（Candida utilisCandida utilis）3. 3. 畢赤酵母屬（畢赤酵母屬（PichiaPichia）（五）其它微生物（五）其它微生物1.1.擔子菌（擔子菌（basidiomycetesbasidiomycetes）即菇類）即菇類（mushroommushroom）2. 2. 藻類（藻類（algaalga）幾幾種種菌菌落落 （六）噬菌體（六）噬菌體（phagephage） 危害以細菌和放線菌危害以細菌和放線菌為

5、生產菌株的發酵工業。為生產菌株的發酵工業。烈性噬菌體烈性噬菌體 引起寄主細胞迅速裂解。引起寄主細胞迅速裂解。 受感染的細菌稱受感染的細菌稱敏感性細菌敏感性細菌。溫和噬菌體溫和噬菌體 隨寄主細胞的繁殖而繁殖。隨寄主細胞的繁殖而繁殖。 含溫和噬菌體的細菌稱含溫和噬菌體的細菌稱溶原性細菌溶原性細菌。 二、微生物工業對菌種的要求二、微生物工業對菌種的要求1.1.原料廉價，生長迅速，目的產物產量高。原料廉價，生長迅速，目的產物產量高。2.2.易控制培養條件，發酵周期較短。易控制培養條件，發酵周期較短。3.3.抗雜菌和噬菌體的能力強。抗雜菌和噬菌體的能力強。4.4.不易變異和退化，不產生任何有害物質和不易

6、變異和退化，不產生任何有害物質和 毒素。毒素。 第二節第二節 工業微生物菌種的選育工業微生物菌種的選育一、自然選育一、自然選育 1.1.采樣采樣 2.2.增殖培養增殖培養 方法：方法： （1 1）控制培養基成分）控制培養基成分 （2 2）控制培養條件）控制培養條件 （3 3）抑制不需要的菌類）抑制不需要的菌類3. 3. 純種分離純種分離（1 1）劃線法：簡單、快捷。）劃線法：簡單、快捷。 （2 2）稀釋法：菌落單一均勻。）稀釋法：菌落單一均勻。固體培養基四區劃法接種法固體培養基四區劃法接種法接種針先以火焰滅菌法滅菌接種針先以火焰滅菌法滅菌 步驟一輕觸營養平板上無菌的瓊脂處冷卻輕觸營養平板上無菌

7、的瓊脂處冷卻 步驟二以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細菌。以接種針輕觸菌落，使接種針上沾有細菌。 步驟三更換一個新的無菌營養平板更換一個新的無菌營養平板 步驟四將接種針上的細菌劃于一個新的營養平板將接種針上的細菌劃于一個新的營養平板上。此為第一菌區上。此為第一菌區 。步驟五重復第一步驟，將接種針以火焰滅菌法重復第一步驟，將接種針以火焰滅菌法滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。滅菌，然后輕觸瓊脂無菌處冷卻。步驟六由第五步驟的第一區中劃出第二由第五步驟的第一區中劃出第二區，如右上圖。區，如右上圖。步驟七重復第六以及第七步驟，由第七步驟的重復第六以及第七步驟，由第七步驟的第二區中劃出第三區，如右上圖。第二

8、區中劃出第三區，如右上圖。 步驟八重復第六以及第七步驟，由第八步驟的第三重復第六以及第七步驟，由第八步驟的第三區中劃出第四區，劃滿剩下的空間。完成后區中劃出第四區，劃滿剩下的空間。完成后的營養平板，如右上圖。的營養平板，如右上圖。步驟九 在營養平板上貼好標在營養平板上貼好標簽，標示好接種日期、操簽，標示好接種日期、操作者姓名、菌種學名以及作者姓名、菌種學名以及培養基名稱。培養基名稱。步驟十步驟十固體培養基的稀釋涂抹接種法固體培養基的稀釋涂抹接種法需要使用的儀器需要使用的儀器震蕩機震蕩機 吸取準備好欲稀釋的菌液吸取準備好欲稀釋的菌液吸取充分均勻后的菌液吸取充分均勻后的菌液 取含有取含有 9mL9

9、mL無菌水之試管，將試管口過火滅菌。無菌水之試管，將試管口過火滅菌。將菌液置入，此時試管須做記號為第一次稀釋。將菌液置入，此時試管須做記號為第一次稀釋。將試管于震蕩機上，使菌液混合均勻將試管于震蕩機上，使菌液混合均勻 取出試管中的第一次十倍稀釋菌液取出試管中的第一次十倍稀釋菌液1mL1mL，加入另一個新的含加入另一個新的含9mL9mL無菌水的試管中。無菌水的試管中。重復此步驟直至所需要的稀釋濃度。重復此步驟直至所需要的稀釋濃度。 從最后稀釋菌液中吸取從最后稀釋菌液中吸取 0.1mL0.1mL菌液，菌液，置入準備好的無菌瓊脂內。置入準備好的無菌瓊脂內。將三角玻璃棒浸于酒精中將三角玻璃棒浸于酒精中

10、 將三角玻璃棒在火焰上燃燒將三角玻璃棒在火焰上燃燒（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒）（須注意勿使燃燒中的酒精滴入酒精瓶中，引起燃燒） 使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養皿置使用玻璃棒將菌液均勻涂布開來，將培養皿置于恒溫培養箱中隔天觀察菌落數目，再依照稀釋倍于恒溫培養箱中隔天觀察菌落數目，再依照稀釋倍數推算出菌液濃度。數推算出菌液濃度。 4. 4. 生產性能的測定生產性能的測定 一般采用兩步法：一般采用兩步法： 初篩：以量為主初篩：以量為主 復篩：以質為主復篩：以質為主 二、誘變育種二、誘變育種 用各種物理、化學的因素人工誘發基用各種物理、化學的因素人工誘發基因突變。因突變。誘變

11、劑：能夠提高生物體突變頻率的物質。誘變劑：能夠提高生物體突變頻率的物質。誘變劑誘變劑物理：紫外線，快中子物理：紫外線，快中子化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍化學：硫酸二乙酯，亞硝基胍 誘變育種的主要環節誘變育種的主要環節（1 1）以合適的誘變劑處理細胞懸浮液）以合適的誘變劑處理細胞懸浮液 誘變誘變（2 2）用合適的方法淘汰負效應變異株，）用合適的方法淘汰負效應變異株， 選出性能優良的正變異株選出性能優良的正變異株篩選篩選 第三節第三節 生產菌種的改良生產菌種的改良 一、原生質體融合（一、原生質體融合（protoplast fusionprotoplast fusion） 1.1.標記菌株的篩選標記菌

12、株的篩選 2.2.原生質體的制備原生質體的制備 3.3.原生質體的融合與再生原生質體的融合與再生 聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）脫水劑）脫水劑 助融劑助融劑 CaCa2+2+提高融合頻率提高融合頻率 4.4.融合子的選擇融合子的選擇二、二、DNADNA重組技術重組技術 （DNA recombination technologyDNA recombination technology） 目標目標DNADNA片斷的獲得片斷的獲得 與載體與載體DNADNA分子的連接分子的連接 重組重組DNADNA分子引入宿主細胞分子引入宿主細胞1.1.從中選出所需重組從中選出所需重組DNADNA分子的宿主細胞分

13、子的宿主細胞 第四節第四節 菌種的衰退、復壯與保藏菌種的衰退、復壯與保藏一、菌種的衰退一、菌種的衰退 衰退的原因：衰退的原因：1.1.菌種保藏不當菌種保藏不當2.2.菌種生長條件沒有得到滿足菌種生長條件沒有得到滿足二、二、 菌種的復壯菌種的復壯 1. 1. 純種分離純種分離 2. 2. 通過寄主體進行復壯通過寄主體進行復壯 3. 3. 淘汰已衰退的個體淘汰已衰退的個體三、菌種保藏三、菌種保藏 1.1.原理原理 低溫、干燥、缺氧、缺營養物質低溫、干燥、缺氧、缺營養物質 2. 2. 方法方法 （1 1）斜面保藏法）斜面保藏法 （2 2）干燥保藏法）干燥保藏法 （3 3）懸液保藏法）懸液保藏法 （4

14、 4）冷凍干燥保藏法）冷凍干燥保藏法 （5 5）低溫保藏法）低溫保藏法 第五節第五節 種子的擴大培養種子的擴大培養一、微生物的培養方法一、微生物的培養方法 1.1.表面培養表面培養 2.2.固體培養固體培養 3.3.液體深層培養液體深層培養二、菌種的擴大培養二、菌種的擴大培養 菌種擴大培養的目的：菌種擴大培養的目的： 為每次發酵罐的投料提供相當數量的為每次發酵罐的投料提供相當數量的代謝旺盛的種子。代謝旺盛的種子。 （一）種子制備的工藝流程（一）種子制備的工藝流程 搖瓶搖瓶保藏菌種保藏菌種 試管斜面活化試管斜面活化 茄瓶斜面茄瓶斜面 種子罐種子罐 固體培養基固體培養基搖瓶搖瓶種子培養種子培養發酵培養發酵培養（二）（二） 斜面菌種的培養斜面菌種的培養 1.1.不宜多次移種。不宜多次移種。 2.2.活化斜面中加活化斜面中加0.1%0.1%葡萄糖。葡萄糖。 培養基特點：原料較精細。培養基特點：原料較精細。（三）一級種子培養（搖瓶）（三）一級種子培養（搖瓶）培養基特點培養基特點： 使用的原料基本接近于發酵培養基。使用的原料基本接近于發酵培養基。（四）二級種子培養（種子罐）（四）二級種子培養（種子罐）培養基的特點