1、1物理圖的繪制234分子信標(biāo)及FRET分析5分子信標(biāo)原理 提出的原因： 分子信標(biāo)的設(shè)想 其是一種設(shè)計巧妙的熒光標(biāo)記的核酸探針。6分子信標(biāo)工作原理7分子信標(biāo)的結(jié)構(gòu) 環(huán) 含識別序列，一般15 -33個核苷酸 莖 在兩末端各接上5到8個核苷酸的互補序列，富含GC 熒光素及猝滅劑89分子信標(biāo)的設(shè)計 分子信標(biāo)探針部分的長度為1533個核苷酸 探針-靶雜交物的熔點，可由GC按規(guī)律預(yù)測 小于20 Tm=2（A+T）4（G+C）10 選定探針序列后，在其兩端各加上一段莖 分子信標(biāo)莖的長度一般為57bp 分子信標(biāo)Tm值，不可從GC含量來推算 G 有時有熒光猝滅作用 分子信標(biāo)和PCR引物之間沒有互補部分 重要一點

2、是讓分子信標(biāo)成為設(shè)計中的發(fā)夾結(jié)構(gòu) 自由能愈高結(jié)構(gòu)愈穩(wěn)定11熒光素 又稱熒光染料，多數(shù)是雜環(huán)或多環(huán)芳烴類化合物 可吸引光能成為不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)，存在時間為10-910-8 s 吸光波長與發(fā)光波長之差，稱為Stokes偏移1213幾個概念 最大激發(fā)波長 最大發(fā)射波長 消光系數(shù) 發(fā)射效率14熒光素的光漂白 熒光基因在激發(fā)態(tài)時受到光的不可逆破壞 解決辦法 抗光漂白試劑加入 用低強度及寬譜帶的光激發(fā)并用最高靈敏度的檢測系統(tǒng)檢測 改用光穩(wěn)定性較好，具有類似吸收/發(fā)射光譜的染料1516猝滅劑 熒光染料發(fā)射的光能，可被鄰近的染料或非染料分子所吸收轉(zhuǎn)成熱能而不再發(fā)射熒光，也可以發(fā)射能量較低的熒光1718PRET

3、激光共振能量轉(zhuǎn)移：受激發(fā)熒光素的能量轉(zhuǎn)移到鄰近的另一熒光素，并不發(fā)射熒光而使激發(fā)熒光素回復(fù)基態(tài)時的現(xiàn)象。 條件 熒光素間的距離要近 光譜要有一定程度重疊1920能量變化的可能情況 內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換 光發(fā)射 動態(tài) 靜態(tài)猝滅 PRET21PRET的基本要求 供體分子喪失激發(fā)能S1到S 0要與受體分子被激發(fā)所需能量相匹配 發(fā)生PRET的另一要求是供體分子與受體分子間的能量轉(zhuǎn)移與距離密切相關(guān)22232425遺傳圖的不足 遺傳圖的分辯率有限 遺傳圖的精確度較低26物理作圖技術(shù) 限制性作圖 依靠克隆的基因作圖 熒光標(biāo)記原位雜交（FISH） 順序標(biāo)簽位點（STS）作圖27限制性作圖 基因原位點工理： 比較不同酶

4、解產(chǎn)生片段的大小 對于2個或者多個相同酶切位點區(qū)域，采用部分酶切 當(dāng)限制位點過多時，采用末端同位素標(biāo)記的方法結(jié)合部分酶解處理28稀有切點限制酶 內(nèi)切酶的類型 內(nèi)切酶的切割結(jié)果 內(nèi)切酶的切割片段的推斷4n 稀有切點限制圖繪制 識別順序越長，產(chǎn)生的片段越大 識別片段的堿基組成影響片段的大小 對于識別位點較長的限制酶，不區(qū)別應(yīng)用 基因組的甲基化狀態(tài)2930DNA分子限制性作圖 限制性作圖只適應(yīng)于較小的DNA分子，上限取決于作圖分子中限制酶位點的頻率。一般50KB以下。 限制圖能否用于50KB以上？31大分子DNA片段的分離 小分子， 一般分子 分子雜交32交變電場瓊脂糖凝膠電泳33基于克隆的基因組作

5、圖 質(zhì)料載體克隆載體及與質(zhì)料結(jié)合的粘粒 擬南芥，1.2108，需要2500個40KB克隆，如果達到99.9%的覆蓋率，需要25000個，人類基因則需要上百萬個。34大分子DNA的克隆載體 YAC（yeast artificial chromosomes,酵母人工染色體） 其是根據(jù)真核染色體的結(jié)構(gòu)設(shè)計的 著絲粒 端粒起點 自主復(fù)制 可載容易為2301700KB之間3536 含有人工染色體的酵母方可在基本培養(yǎng)基中生長， 插入片段存在時，酶失活，克隆顯示紅色，否則為白色37YAC缺陷 插入部分的穩(wěn)定性問題 同一細胞內(nèi)不同YAC的重組交換，形成嵌合順序38噬菌體P1載體 將天然噬菌體基因組中的一段缺失

6、，容易相當(dāng)于缺失區(qū)段的大小及顆粒所容納的空間。 可達125kb3940 是 Sternberg 基于 P1 噬菌體構(gòu)建的，與黏粒載體工作原理比較相似的一種高通量載體。它含有很多 P1 噬菌體來源的順式作用元件，能容納 70100kb 大小的基因組DNA片段（Sternberg 1990, 1992, 1994） 。在這種系統(tǒng)中，含有基因組和載體序列的線狀重組分子在體外被組裝到 P1 噬菌體顆粒中，后者總?cè)萘靠蛇_ 115kb （包括載體和插入片段）。將重組 DNA 注射到表達 Cre 重組酶的大腸桿菌中，線狀 DNA 分子通過重組于載體的兩個 loxP 位點之間而發(fā)生環(huán)化。另外，載體還攜帶一個通

7、用的選擇標(biāo)記 kan r ，一個區(qū)分?jǐn)y帶外源 DNA 克隆的陽性標(biāo)記 sacB 以及一個能夠使每個細胞都含有約一個拷貝環(huán)狀重組質(zhì)粒的 P1 質(zhì)粒復(fù)制子。另一個 P1 復(fù)制子（ P1 裂解性復(fù)制子）在可誘導(dǎo)的 lac 啟動子（IPTG 誘導(dǎo)）控制下，用于 DNA 分離前質(zhì)粒的擴增。41 結(jié)合了 P1 載體和 BAC 載體的最佳特性，包括陽性選擇標(biāo)記 sacB 及噬菌體 P1 的質(zhì)粒復(fù)制子和裂解性復(fù)制子。然而除了將連接產(chǎn)物包裝進入噬菌體顆粒以及在 cre-loxP 位點使用位點特異性重組產(chǎn)生質(zhì)粒分子以外，在載體連接過程中產(chǎn)生的環(huán)狀重組 PAC 也可能用電穿孔的方法導(dǎo)入大腸桿菌中，并且以單拷貝質(zhì)粒狀

8、態(tài)維持 （Ioannou et al. 1994） 。代表性 PAC 載體 pCYPAC1 遺傳結(jié)構(gòu)圖 見圖 3-30 。基于 PAC 的人類基因組文庫插入片段的大小在 60kb150kb 之間。 42細菌人工染色體 BAC（bacterial artificial chromosomes) 其源于大腸桿菌的F質(zhì)料，容易可達300KB 特點： 單拷貝復(fù)制 相對分子質(zhì)量大 穩(wěn)定 制備方法簡單，便于機械化操作43BAC載體物理圖44P1人工染色體 PAC（P1derived artificial chromosomes) 結(jié)合了P1載體與BAC載體的優(yōu)點，可載片段達300KB45P1人工染色體46

9、47F粘粒 具有F質(zhì)料的復(fù)制起點及的COS位點，功能與粘粒類似，拷貝數(shù)低。48重疊群的組建 相互重疊的DNA片段組成的物理圖稱為重疊群，其組建采用染色體步移法。 從基因組文庫中挑取一個指定的或者隨機的克隆，然后尋找與之重疊的另一個 依次延伸。4950指紋作圖 在基因組范圍內(nèi)查找重疊的克隆，最好的方法首推克隆指紋排序。 指紋系指確定DNA樣品所具有的特定DNA片段組成，一個克隆的指紋表示了該克隆具有的限定的順序特征。51限制性帶型指紋 限制性酶處理 凝膠分離 DNA片段部分相同，說明具有重疊的順序52重復(fù)順序DNA指紋 不同克隆的DNA用限制性酶處理 雜交 具有相同的帶型，說明具有相同的重復(fù)順序

10、53重復(fù)順序DNAPCR指紋 確定重復(fù)順序之間的單一順序 設(shè)計重復(fù)順序互補的引物，進行 凝膠分離比較帶型差異 A平均為4KB，54STS目錄作圖 需要將某一克隆重疊群錨定到現(xiàn)有已具有STS標(biāo)記的物理圖上時，此法有效。 根據(jù)STS設(shè)計引物，凡能擴增出條帶的克隆，具有順序重疊的插入子。5556熒光標(biāo)記原位雜交 Fluorescent in situ hybridization , FISH 標(biāo)記信號為熒光素， 結(jié)果可在顯微鏡下觀察，直接顯示探針與染色體雜交的位置。 原位雜交：靶子為完整的染色體，由雜交信號提供作圖信號，DNA變性時不破壞染色體自然形態(tài)，575859與同位素探針雜交的區(qū)別 方法基本一

11、致， 探針差異，解決敏感性與分辯率之間的矛盾 對于重復(fù)順序的存在，采用預(yù)先與重復(fù)順序結(jié)合的方法，封閉部分結(jié)合點，降低非特異性順序的干擾60原位雜交的原理及應(yīng)用 對特定探針而言，原位雜交所的中期染色體熒光信號所處的位置與染色體短臂末端的相對距離是不變的，經(jīng)比例換算可標(biāo)注在連鎖圖上。 此僅僅應(yīng)用于確定新發(fā)現(xiàn)的標(biāo)記屬于那條染色體 原位雜交的分辯率取決于雜交技術(shù)及染色體在制備時所處的狀態(tài)61其它染色體的選用 機械伸展的染色體 利用離心剪切力使染色體長度增加20倍 非中期染色體 利用新的方法，使染色體可既松散又保持分辨特征的染色體62順序標(biāo)簽位點作圖 限制性作圖快速，提供詳細的信息，但不適合大基因組 重

12、疊群構(gòu)建程序復(fù)雜，費時費力 指紋作圖對大基因組仍存在問題 原位雜交操作困難，資料累積慢，一次實驗定位的分子標(biāo)記不超過34個63STS繪圖 順序標(biāo)簽位點或STS（sequence tagged site）為一段長度100500BP的單一DNA順序，易于分辨。 如果兩個序列片段含有同一STS，則表示兩個序列片段重疊。 2個STS出現(xiàn)在同一片段中的機會取決于他們的位置是否靠得近。64STS作圖原理65合格的STS特點 序列已知 在染色體上獨一無二66尋找STS辦法 表達序列標(biāo)簽（expressed sequence tag ,EST)從cDNA克隆中找到小段順序 SSLP 具有多態(tài)性并已在連鎖分析中定位的SSLP具有特別的價值。 隨機基因組測序67STS的物理定位 輻射雜種 克隆作圖68輻射雜種 含有另一種生物染色體片段的嚙齒類細胞 人體細胞射線照射，染色體隨機斷裂，劑量與片段大小成反比。將輻射后細胞與正常倉鼠細胞融合，片段將整合到鼠類細胞染色體中進行擴增。 利用胸苷激酶或次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶的缺陷細胞，采用HAT培養(yǎng)基選擇。獲得TK和HPRT基因的可生長。 一般每個陽性雜種細胞保存DNA占人基因組1530%，510Mb6970僅含單個染色體的雜種