1、發酵過程中染菌的有效控制及預防邢攀科摘要：針對微生物發酵過程中的染菌現象，分析了導致發酵染菌的幾種主要原因，并提出了有效控制方法，以預防為主，及時觀察分析，杜絕發酵染菌的隱患。關鍵詞：發酵染菌微生物發酵前言：雜菌感染，簡稱染菌，普遍存在于微生物發酵工業生產中。特別是夏季，隨著氣溫的不斷升高.在丙酮、醇糧食發酵法工業生產中尤其突出5。發酵過程是利用某種特定的微生物在一定的環境中進行新陳代謝，從而獲得某種產品。現代發酵工業要求純種培養，不僅斜面、種子和培養基以及發酵罐、管道等須經嚴格滅菌除去各種雜菌，而且在需氧發酵中通入的空氣也需經過除菌處理。只有這樣，才能確保生產不受雜菌污染，從而保證生產菌的旺

2、盛生長。染菌的結果，輕者影響產量或產品質量，重者導致倒罐，甚至停產。工業發酵中污染雜菌造成的損失是十分驚人的，所以必須認真對待除菌。1發酵過程對設備的要求1.1 發酵罐發酵罐在使用之前，需要進行認真檢查，以消除染菌隱患，如攪拌系統轉動有無異常；機械密封是否嚴密：罐內的螺絲是否松動；罐內的管道有無堵塞；夾層或罐內盤管是否泄漏；罐體連接閥門嚴密度等等。機械密封目前在發酵罐上得到廣泛應用，取代了以前攪拌軸采用的填料密封形式，但是由于安裝精度不高或選用的機械密封不合適，仍然會由于軸封泄露造成染菌，因此在安裝攪拌軸時要注意對中，為了便于觀察罐內發酵情況，在人型發酵罐內一般設置有沖洗視鏡的蒸汽管道，但是蒸

3、汽一旦冷凝在管道中，冷凝水并不能完全保證無菌，因此沖洗視鏡的蒸汽管道要去除，杜絕染菌隱患。如果罐內霧氣大看小清楚，可以采用更高亮度的視鏡燈6。1.2 發酵罐附屬設備發酵罐附屬設備有空氣凈化系統，溫度、壓力流量等控制系統及相應的管道閥門。哪一個環節出問題都會造成發酵失敗3。1.2.1 空氣凈化系統傳統的空氣凈化使用活性炭、棉花、超細玻璃纖維紙做過濾器Ul,過濾效果差，操作復雜。目前國內的膜過濾技術比較成熟，用偏二氟乙烯(PVDF)制成的折疊微孔濾膜濾芯，過濾精度高，流量大。使用時只要注意過濾器前壓縮空氣除濕脫油，并按規范對過濾器滅菌，空氣保證無菌還足沒有問題的。而且PVDFS對壓縮空氣中的水分不

4、敏感，膜本身的疏水性強，使用中注意過濾器排水，解決了以前當空氣濕度過大導致棉花過濾器不能使用的問題3。1.2.2 溫度、壓力流量等控制系統發酵罐實消是對發酵培養基進行徹底的滅菌處理，利用高溫過飽和蒸汽的強穿透能力使各種細菌、真菌蛋白質凝固而死亡。在工業滅菌中，對預熱時間、蒸汽閥門的開度、滅菌溫度、滅菌壓力和泡沫控制等，都有嚴格要求，一個環節出現問題，就容易導致染菌。一般工業上滅菌溫度在1100C,滅菌壓力O.SMP以上，而保證滅菌溫度和壓力準確的就是各種溫度探頭、壓力傳感器。因此定期對這類探頭、傳感器、電極的檢定十分重要3o1.2.3 閥門閥門對介質的密封性可分為4級3,公稱級、低漏級、蒸汽級

5、和原子級。公稱級與低漏級密封適用于關閉要求不嚴密的閥門，例如用于控制流量的閥門。蒸汽級密封適用于蒸汽和大部分其他工業用閥門的閥座、閥桿和閥體連接部的密封。原子級密封適用于介質密封性要求極高的場合，如宇宙飛船和原子能動力設備等。發酵工業中由于使用高溫蒸汽對發酵設備進行滅菌，因此閥門要求是蒸汽級密封。閥門在發酵設備中使用最多，用的閥門也有各種型號，考慮到閥門使用范圍和易于維護，發酵工業上使用最多的是截止閥。近年來國內已開發發酵專用閥門，效果較為理想，如條件許可，也可選用。2發酵過程對空氣的要求采用空氣凈化設備系統制備無菌空氣，要嚴格控制好下述兩點：一是提高空氣進入壓縮機之前的潔凈度，二是除盡壓縮空

6、氣中夾帶的油水。否則會影響無菌空氣質量1?？諝膺^濾器工業用的空氣除菌系統中的空氣過濾器一般都比較龐大，如果其中的纖維鋪設不勻，密的部分阻力大，松的部分阻力小，就會使較多的空氣沿著阻力小的部分流出，從而形成短路。走短路的那部分空氣沒有經過充分過濾而帶菌，進入發酵罐將使發酵染菌。纖維層裝得太松對過濾不利，太緊同樣也會影響過濾效率。同時，在過濾介質用蒸汽滅菌時，太緊則蒸汽穿透力差，穿透力差滅菌效果也差。所以用過分壓實纖維層的辦法試圖達到增加過濾效率的目的，實際上是適得其反。對于棉花過濾器最合適的充填密度是160180公斤/米3;玻璃纖維是130180公斤/米3左右。在鋪纖維時分層均勻鋪設是必要的。過

7、濾器器壁腐蝕形成氧化鐵層，氧化鐵是一種多孔物質，空氣會在其中穿過而得不到過濾，因而也會使空氣中帶茵并造成污染。采用活性炭棉花作為過濾介質的空氣過濾器，活性炭受到氣流的沖擊互相碰撞、摩擦而破碎并逐漸灰化，使活性炭的體積減小空間增大，上下兩端的棉花受空氣的頂撞力而逐漸改變位置。之后，灰化的活性炭隨氣流逸出，整個過濾介質的體積減小使過濾層傾斜甚至發生翻身的現象，致使大量未經過濾的空氣進入發酵罐內造成嚴重的染菌事故。在用蒸汽滅菌時，檢查排出蒸汽的情況可以判斷過濾層是否有問題。排出蒸汽均勻并呈青色有力表示情況良好，排出蒸汽呈霧狀無力表明壓得太緊，而當排出蒸汽斷續不均勻以及進出口兩測的壓力降過小時則就有可

8、能是過濾層有位移現象，發現不正常的情況應立即予以糾正。大多數產品在整個發酵期間需要改變空氣流量，但油水分離設備、過濾器的過濾面積和長度是根據空氣流速來設計的，空氣流速的改變就會影響油水分離效果和過濾效率，所以設計時要充分注意這種情況，掌握空氣流量改變的范圍，選擇合適的空氣流速。生產時各罐的發酵時間要盡量叉開，使空氣流量均勻。檢查介質是否失效首要原因是油水分離系統效果不佳，油水分離不完全，進入總過濾器的空氣相對濕度遠高于5060,使棉花活性炭過濾器和超纖維過濾器的過濾介質受潮而失效，這時應分別檢查冷卻、分離和加熱效果，確定原因。當然空氣系統所有的設備必須定時打開排污閥排去油水，否則若設備內積污液

9、太多也會使介質受湖，應落實制度定時排污。另外，過濾器的蒸汽閥門漏，也會使介質受潮，應檢查。第二種原因是總過濾器的棉花活性炭翻身，空氣走短路，過濾器沒有起到應有靜過濾作用，雜菌沒有濾除，而進入發酵罐與種子罐，導致染菌。第三種愿因是遏到染菌，拆裝過濾器后，把棉花介質壓得太緊，這樣，雖然過濾效果好，但因介質太緊，使蒸汽穿透困難，導致過濾器滅菌不透而染菌。這種情形可根據正常使用時，過濾器前后的空氣壓差來判斷，若壓差大，說明介質裝填太緊。具體裝置可根據計算確定懷疑空氣系統染菌時，既要檢查油水分離情況，又應拆裝過濾器。若是新建工廠出現大批連續染菌，如確定是空氣染菌，有可能是設計問題，這時應根據發酵規模及環

10、境污染程度，更改設計的過濾器內空氣線速度，提高其分離效率。3種子帶菌的防止種子帶菌的的主要原因有以下幾方面：一是培養基及其用具的滅菌不徹底，二是菌種在保藏和培養過程中染菌，三是在移接過程染菌。因此應對培養基、培養菌種所用的工具進行充分滅菌；同時對培養環境、菌種保藏環境和無菌室進行充分的滅菌；另外就是在菌種的移接過程中應嚴格按照無菌操作進行4o3.1無菌室接種、移種等無菌操作需要在無菌室內進行。無菌室面積一般6m2（長3m寬2m高2項2o為了減少外界空氣的侵入，無菌室要有13個套間（緩沖過道）。無菌室內部的墻壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求無裂縫，墻角最好做成圓弧形，便于揩擦清洗以減少空氣

11、中微生物的潛伏場所，室內布置應盡量簡單，最好能安裝空氣調節裝置，通入無菌空氣并調節室內的溫濕度。無菌室的每個套間一般都用紫外線滅菌。通常用30瓦紫外線滅菌燈照射2030分鐘即可。紫外線殺菌的效率還與室內空氣的性質有關；空氣溫度高殺菌效率高，空氣中灰塵多殺調效率低，而相對濕度高則紫外線燈的使用壽命長。紫外線能穿過石英但不能透過玻璃。配合使用的化學滅菌藥劑有：用作噴灑或揩擦的（以揩擦為主）有75%酉精、0.25%新潔而滅（季胺鹽）、0.61%M白粉、0.5%石炭酸、0.5%過氧乙酸、1%8酚皂（來蘇爾）、0.5%高鈕酸鉀、300單位/毫升土霉素、50單位/毫升制霉菌素等；用作熏蒸的有甲醛（每立方米

12、空間約用10毫升）或硫磺（每立方米空間約用23克）。要根據不同情況采用不同的滅菌劑。如檢查出無菌室中潛伏的微生物中細菌較多，用石炭酸、土霉素等滅菌較好；如無菌室中霉菌多可以采用制霉菌素；如有噬菌體則用甲醛、雙氧水或高鈕酸鉀等較好。無菌室內無菌度的要求是：把無菌培養皿平板打開蓋子在無菌室內放置30分鐘，根據一股工廠的經驗，長出的菌落在3個以下為好在種子的無菌條件不要求很高的情況下，可以不采用無菌室而直接用無菌箱進行操作，但無菌要求很高的情況下，即使在無菌室內還要用無菌箱操作。無菌室的利用次數要恰當，每次使用時間也不宜過長。用具要經蒸汽滅菌或用滅菌劑揩擦后才能帶入使用。滅菌鍋滅菌鍋是一種壓力容器，

13、作為培養種子及小型試驗用具的滅菌之用，有立式和臥式兩種。滅菌操作時需要注意排氣管是否暢通，因為滅菌鍋的排氣管較小，易被鐵銹或瓶子破碎后的培養基等所堵塞。如果排氣管不道，鍋內空氣排不出去形成氣團，蒸汽就不易滲入，從而使滅菌不徹底。用某種較耐熱的芽抱桿菌進行試驗證明：在排氣不通暢的情況下，以1公斤/厘米2的蒸汽壓力經30分鐘滅菌后進行檢查，發現某些部位的三角瓶中，滅菌前放入的芽抱桿菌沒有被殺死。如果不是采用蒸汽而是用鍋內燒水的辦法進行滅菌，那末排氣的時間更要長一些，不然水蒸汽來不及驅出空氣而使被滅菌的瓶中的冷空氣排不盡。搖瓶機搖瓶機（亦稱搖床）是培養好氣菌的小型試驗設備或作為種子擴大培養之用，常用

14、的搖瓶機有往復式和旋轉式兩種。往復式搖瓶機的往復頻率一般在80140次/分，沖程一般為614厘米，如頻率過快、沖程過大或瓶內液體裝料過多，在搖動時液體要濺到包瓶口的紗布上易引起染菌，特別是啟動時更易發生這種情況。旋轉式搖瓶機的偏心距一般在36厘米之間，旋轉次數為60300轉/分。放在搖瓶機上培養瓶中發酵液所需的氧是由室內空氣經瓶口包扎的紗布（一般是八層）或棉塞通入的，所以氧的傳遞與瓶口的大小，瓶口的幾何形狀和棉塞或紗布層的厚度和密度有關。在通常情況下，搖瓶的氧吸收系數（亞硫酸氧化值）Kd取決于搖瓶機的特性和三角瓶的裝料量。往復式搖瓶機是利用曲柄原理帶動搖床作往復運動，機身為鐵制或木制的長方形框

15、子，有一層至三層托盤，托盤上開有圓孔備放培養瓶，孔中凸出一三角形橡皮，用以固定培養瓶并減少瓶的震動，傳動機構一般采用二級皮帶輪減速，調換調速皮帶輪可改變往復頻率。偏心輪上開有不同的偏心孔，以便調節偏心距。往復式搖瓶機的頻率和偏心距的大小對氧的吸收有明顯的影響。據有關文獻報導，當沖程為10厘米、往復頻率為200次/分，K值可達2.41毫克分子氧/升，分，大氣壓；當沖程為5厘米、往復頻率240次/分時，Kd值可達1.25毫克分子氧/升，分，大氣壓。根據支承裝置結構不同，往復式搖瓶機分為滾輪式和懸掛式兩種。滾輪式搖瓶機是將搖床置于四個滾輪上，懸掛式搖瓶機是用四條吊桿將搖床吊在機架上，結構較為簡單，托

16、盤可裝至三層以上，能放510升甚至更大的瓶，動力消耗較少。但懸掛式搖瓶機如為多層時，每層的沖程不一樣，越是上層沖程越小。故使用多層懸掛式搖瓶機時應予注意。旋轉式搖瓶機是利用旋轉的偏心軸使托盤擺動，托盤有一層或兩層，可用不銹鋼板、銅板、塑料板或木板制造。托盤由三根呈等邊三角形分布的偏心軸支承，也有用滾動軸承作支承的。在三個偏心軸上裝有螺栓可調節上下，使托盤保持水平。此種搖瓶機結構比較復雜，加工安裝要求比往復式高，造價也較貴。其優點是氧的傳遞較好，功率消耗小，培養基不會濺到瓶口的紗布上。有關文獻報導，采用旋轉式搖瓶機，對于300毫升或600毫升的三角瓶，當轉數在500轉/分和具有各種擋板條件下，與

17、實裝培養液10升具有六葉渦輪攪拌器的實驗型發酵罐(通風率0.6米vvm；1000轉/分)的(值一樣。所以搖瓶機將成為放大發酵試驗過程中的一種更有效的工具。4染菌后的挽救措施為了減少損失，對被污染的發酵液要根據具體情況采取不同的挽救措施。如果種子培養或種子罐中發現污染，則這批種子就不能再繼續擴大培養，因為此時的損失畢竟是很小的。發酵早期染菌可以適當添加營養物質，重新滅菌后再接種發酵。中后期染菌，如果雜菌的生長將影響發酵的正常進行或影響產物的提取時，應該提早放罐。但有些發酵染菌后發酵液中的碳、氮源還較多，如果提早放罐，這些物質會影響后處理提取使產品取不出，此時應先設法使碳、氮源消耗，再放罐提取。在

18、染菌的發酵液內添加抑菌劑(如小劑量的抗菌素或醛類)用以抑制雜菌的生長也是一種辦法。抑菌劑要事先經過試驗，確實證明不妨礙生產菌的生長和發酵才能使用。因而不是所有發酵都能使用抑菌劑。另外，采用加大接種量的辦法，使生產菌的生長占絕對優勢排擠和壓倒雜茵的繁殖，也是一個有效的措施。還有將種子罐中種子培養好后，進行冷凍保壓(1.5公斤/厘米2,10C左右)，經平板檢查證明無雜菌后，再接入發酵罐發酵，這一措施在一些谷氨酸發酵生產工廠取得很好效果。有時發酵罐偶而染菌，原因一時又找不出，一般可以采取以下措施：(1)連續滅菌系統前的料液貯罐在每年410月份(雜菌較旺盛生長的時間)加入0.2%甲醛，加熱至80C,存放處理4小時，以減少帶入培養液中的雜菌數。(2)對染菌的罐，在培養液滅菌前先加甲醛進行空消處理。甲醛用量每立方米罐的體積0.120.17升。(3)對染菌的種子罐可在罐