1、 膜蛋白的提取方法-全攻略一、膜蛋白簡介 膜蛋白在細胞中扮演著重要的角色：例如被熟知的識別、信號轉導、運輸等功能，也是用藥的抱負的靶點，雖動物細胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數膜蛋白分子數目較少，但卻給予細胞膜特別重要的生物學功能。 依據膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內在膜蛋白。 (1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質分子或脂分子結合，因此只要轉變溶液的離子強度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結構并不被破壞。 (2) 內在膜蛋白與膜結合特別緊密，一般只有用去垢劑(detergent)使其膜解后才可分離出來

2、。 附注：使用分級抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區的整合膜蛋白。 二、膜蛋白的提取方法談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過濾法、等電點沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法有時這些方法常常組合到一起對特定的物質進行分離純化。由于蛋白質種類繁多，不同的蛋白質由于結構和組成的差異，其溶解 度也各不相同.依據蛋白質的溶解特性，同時可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機溶劑提取.但是與胞質蛋白，核蛋白提取不同之處在于膜蛋白是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質蛋白等，然后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純

3、化的重要步驟是選擇適當的增溶用表面活性劑，一般常用的有膽酸鹽，CHAPS(一種離子去污劑），Emulgen和Lubrol等表面活性劑。 1）先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復凍融法、超聲裂開法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細胞裂開，然后通過梯度離心得到含有膜蛋白的粗組分。（例如：用液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑，然后差速離心、蔗糖密度梯度離心。收集37%與41%間的成分，即為質膜部分。裂解即可收集膜蛋白 ） 2）用特別的去污劑選擇性的分離。 從膜上提取蛋白有很多困難。在多數情況下，都是接受去垢劑將疏水蛋白從其膜結構中溶解下來，然后將蛋白質穩定。去垢劑的選擇通常是依據他對

4、所需要蛋白質的提取效率來確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟。雖然很多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑。這常常會引起蛋白質失活，但如果蛋白質是用于測序的，他將不是一個問題。如果不是用于測序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.很多文獻和生化試劑供應商的產品名目中，都介紹有很多種不同的可用來溶解膜蛋白的去垢劑.然而，他們并不是普遍適用的.在設計膜蛋白溶解方案時，必須考慮某一去垢劑的特別性質.如 triton X-100在280nm處有吸取，如果某蛋白質的測試與280nm處的吸取有關，就應避開使用這類去垢劑. 將膜制劑與胞質蛋白及細胞核分離后，再進一步從

5、細胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來.這種做法的好處是可以用強烈的去垢劑提取細胞骨架的相關蛋白，而無需考慮胞質蛋白、細胞核成分或染色質成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白，無論在種類上還是數量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（<5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無疑對于商量膜蛋白的結構和功能都是特別重要的. 酸溶解法簡潔，牢靠，但有時含有其他蛋白。一般的都是利用4時全部的蛋白質原則上都溶于Triton X-114水溶液，在溫度超過20時，此溶液分為水相和去污相；此時親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質可提取膜

6、蛋白。3 )膜蛋白色譜(Chromatography of Membrane Protein,CMP)：CMP分離強疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團（P-端），又具有陽離子鈣（C-端），與固定相結合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結合量。利用原子散射法商量cAMP的分離機制發現，樣品與SDS結合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達到分級分離的目的。 4) 挨次抽提法：依據細胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進行抽

7、提的方法。用Tris堿溶液裂解細胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的沉淀用標準液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復合表面活性劑的蛋白溶解液，可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。 5)離心蛋白提取法（centrifugal protein extraction） 原理：高滲的蛋白裂解液讓細胞溶脹裂開后，超高速離心 評價：盡管分級(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復的點.該方法相較MOLLOY MP教授在1998年electrophoresis上發表的分級抽提法減去了第一步(用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡化,總而言之是一

8、種不錯的方法。 6)detergent- based：提取時先用裂解液裂解胞膜（選用不同的去污試劑是關鍵），梯度離心分離細胞器(ER)，然后分級抽提方法。例如，去掉細胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時不溶的部分。 細胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫集中、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質濃度的定量測定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸取法定量鑒定膜蛋白，便利迅速。 注意事項：膜蛋白的含量比較少，需要收集大量的細胞，艾美捷推舉用試劑盒提取膜蛋白如：膜蛋白細胞組分提取試劑盒，很短的時內得到高純度的蛋白并且具有天然活性的多層跨膜蛋白，且能夠有效的去除多糖、核酸等雜質。 內容總結（1）膜蛋白的提取方法-全攻略一、膜蛋白簡介 膜蛋白在細胞中扮演著重要的角