1、 作者：顏政 周為 方馳華 作者單位：(1.青海高校附屬醫院腫瘤外科;2.南方醫科高校珠江醫院肝膽外科)【摘要】 目的 探討卵圓細胞部分表面標記在肝細胞癌中的表達狀況和意義。方法 應用免疫組織化學SABC法檢測20例肝細胞癌中CK7、CK19、CK18、CD34、c-kit 抗原的表達。結果 14例肝細胞癌CK7表達呈陽性，其陽性表達率為70%(14/20);9例c-kit 的陽性表達率為45%(9/20);在20例肝細胞癌癌組織中的CK18全部呈陽性表達，CK19和CD34全部呈陰性表達。CK7、c-kit表達與患者年齡、性別無關，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學分級也不相關(P0.05

2、)。結論 肝細胞癌癌組織中存在表達卵圓細胞表面標記的細胞，其表達CK7、c-kit，不表達造血干細胞標記物CD34。其進一步提示，肝細胞癌可能不是起源于肝干細胞而是來源于過渡性的前體細胞/祖細胞，如來源于Hering管的卵圓細胞。 顏政(1963)，男，漢族，湖南籍，副主任醫師,博士【關鍵詞】 卵圓細胞 表面標記 肝細胞癌 肝臟干細胞EXPRESSION AND SIGNIFICANCE OF SURFACEMARKERS OF OVAL CELLS IN HEPATIC CELLULAR CARCINOMAYan Zheng1， Zhou Wei1， Fangh Chihua2(1.Depa

3、rtment of Tumor Surgery, Qinghai University Affiliated Hospital;2.Department of General Surgery, Zhujiang Hospital, The Southern Medical University)Abstract Objective To identify the expression of surface markers on oval cells and explore its implications in hepatic cellular carcinoma(HCC). Methods

4、Surface markers of oval cells (CK7, CK18, CK19, CD34 and c-kit) antigen was tested using histochemical method (SABC) in 20 cases with hepatic cellular carcinoma. Results Expression of CK18 was positive in all 20 hepatic cancer samples. Expression of CK19 was not observed in all hepatic cancer sample

5、s except in the sample of epithelial cell of small bile duct and expression of CD34 was not observed in all hepatic cancer samples. CK7 expression was positive in 14 HCC samples (14/20, 70%) and c-kit expression was positive in 9 samples (9/20, 45%). Expression of CK7 and c-kit were not found in 4 s

6、amples of parenchyma cells of normal hepatic tissues. The expression of CK7 and c-kit is not related to the age, gender of patients, neither to compilation of hepatocirrhosis or histological classification (P 0.05). Conclusion In HCC tissues, there are cells that can express surface markers of oval

7、cells. These cells can express CK7 and c-kit, but cannot express CD34, the marker of hematopoietic stem cell. This suggests that HCC may not be originated by hepatic stem cell, but rather by transitional progenitor cell, such as the oval cell originated from Hering duct.Key words Oval cell Surface m

8、arker Hepatic cellular carcinoma Hepatic stem cell 目前，有關肝細胞癌的細胞源商量取得了較大進展，已有實驗提示肝內卵圓細胞在致癌因素的作用下可向癌細胞異常分化，已經有不少學者從肝癌組織中發現了卵圓細胞(Oval cell,OVC)的存在1，2。但原發性肝癌是否來源于肝卵圓細胞成熟受阻的過程還未有定論，因此沒有肝卵圓細胞進展為原發性肝癌的直接證據。肝卵圓細胞是肝干細胞的子代，被認為是由干細胞分化而來，具有雙向分化潛能，既可分化為肝細胞，也可分化為膽管上皮細胞，具有一過性地表達肝細胞和膽管細胞的特性。因此，卵圓細胞既部分表達 肝細胞型 CK組型CK

9、8和CK18，還表達 膽管型 CK組型CK7和CK19。很多學者提出上述特性甚至可以在肝細胞性肝癌(Hepatic Cellular Carcinoma,HCC)及膽管細胞性癌(Intrahepatic Cholanglo Carcinoma, ICC)中得到保持。然而，目前對此生疏尚未統一。假設肝細胞癌來源于肝臟干細胞，我們擬利用免疫組織化學商量方法檢測肝臟干細胞部分表面標記在肝細胞癌癌組織中的表達，探究肝細胞癌卵圓細胞可能的起源。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 病理組織20例肝細胞癌組織及4例正常肝臟標本均取自南方醫院外科。肝細胞癌為主要商量對象，取正常肝組織作正常對比。肝癌組織標本

10、均在患者首次手術時從肝內取材(全部病人術前均未行化療和放療)，主要觀察腫瘤組織和癌旁組織。全部組織用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋，切片(4 m)備用。1.1.2 主要試劑第一抗體是鼠抗人CK7IgG 、CK19 IgG、CK18 IgG、CD34 IgG、c-kit IgG，由北京中山生物公司供應，稀釋比例為1:100;正常山羊血清封閉液為武漢博士德生物公司產品。其次抗體免疫組化檢測試劑及顯色劑DAB為北京中山生物公司產品。1.2 實驗方法標本常規脫蠟、水化。PBS洗滌(5 min 2次)，用3 % H2O2 阻斷內源性過氧化酶，用微波修復抗原，PBS洗滌(2min 3次)，滴加羊血清封

11、閉液，室溫下孵育10 min;滴加一抗IgG，37水浴孵育2 h， PBS洗滌(2min 3次)，滴加生物素二抗羊抗鼠IgG，37水浴孵育20min;PBS洗滌(2min 3次)，滴加試劑SABC，37水浴孵育20 min，PBS洗滌(2min 3次)，DAB顯色;蘇木素輕度復染50s，經脫水、透明處理后用中性樹脂封片，待鏡下觀察。用PBS代替一抗作陰性對比，用已知c-kit 和CD34表達呈陽性的胃腸道間質瘤組織作陽性對比，細胞漿和(或)細胞膜呈棕黃色為陽性染色。取5個有代表性的高倍鏡視野，觀察100個細胞并計算陽性細胞數，平均陽性細胞數 10%為陽性。1.3 統計學處理應用SPSS10.0

12、軟件進行統計處理。組間患者的年齡比較應用獨立樣本t檢驗;各組間比較接受兩獨立樣本秩和檢驗或Fishers精確概率檢驗;P 0.05為有顯著意義。2 結果2.1 臨床病理特征20例肝細胞癌組織均經術后病理確診，其中高分化癌4例，中分化癌12例，低分化癌4例。20例患者中，男性15例，女性5例;合并肝硬化者10例，腫瘤直徑大于3 cm 者12例(表1)。切片經蘇木精-伊紅染色后在光鏡下觀察，癌細胞胞漿呈嗜伊紅性，核深染色大小不等，多見核分裂相。2.2 免疫組化結果在20例肝細胞癌組織中CK18表達均呈陽性，CK18表達于細胞漿及細胞膜，呈棕黃色，CK18表達陽性細胞呈彌漫性分布(圖1)。在20例肝

13、細胞癌組織細胞中，除了在小膽管上皮表達CK19外，沒有1例腫瘤細胞表達CK19(圖2)。正常肝組織的肝細胞表達CK18，膽管上皮表達CK19。CK7 多表達于細胞漿，顏色為棕黃(圖3)。CK7 陽性細胞呈點狀、片狀分布，或呈彌漫性分布，可以位于癌組織中央區域，也可以位于癌結節的外緣;還可見到較腫瘤細胞小，而形態呈卵圓形的CK7表達陽性細胞分布在癌結節外，其細胞核大，胞質少，核漿比高 (圖4)。表1顯示，14例肝細胞癌CK7表達陽性，表達率為70%(14/20)，在4例正常肝臟的實質細胞內未見CK7表達，CK7表達與患者年齡、性別無關，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學分級也不相關(P0.05

14、)，見表2。表120例肝細胞癌病人臨床病理特征c-kit表達于細胞質與細胞膜，陽性染色者為棕黃色細顆粒狀，陽性細胞呈散在或片狀分布，在癌結節的外圍可見到黃染的小卵圓細胞(圖5)。9例表達c-kit，陽性率為45%(9/20);在4 例正常肝組織實質細胞內未見c-kit 表達。此外，c-kit 表達與患者年齡、性別無關，與腫瘤大小、是否合并肝硬化以及組織學分級也不相關(P0.05)，簡略結果見表3。在20例肝細胞癌組織中， 除毛細血管上皮表達CD34外，沒有1例腫瘤細胞表達CD34。表2肝細胞癌CK7 免疫組化和臨床病理特征3 商量通常正常肝細胞表達肝細胞型表面標記CK18、CK83,4，而膽管

15、細胞表達膽管型的表面標記CK7，CK1935。很多學者提出上述差別甚至可以在HCC及膽管細胞性癌ICC中得到保持。因此，CK組型曾被用作肝癌分型的一種標志。然而，目前對此還存在爭議，有學者對HCC進行石臘切片和免疫組織染色，發現其內含有CK19 異常表達的癌細胞6。另有學者認為HCC來源于一種能表達 膽管型 CK的細胞7，因此認為肝細胞特異性表型在腫瘤發生過程中并不總是保持不變8。而我們的商量發現，全部樣本肝細胞癌組織都表達CK18，部分表達CK7，不表達CK19，部分支持上述觀點，提示肝癌可能來源于一種能表達 膽管型 CK的細胞。卵圓細胞是肝干細胞的子代，一般認為位于小葉膽管和 Hering

16、 管道中，具有雙向分化潛能，既可分化為肝細胞，也可分化為膽管上皮細胞9，因此肝臟祖細胞表達膽管上皮和肝細胞標記。從個體發生來看，肝干細胞分化的不同時期表達不同的標記。在人類妊娠814周，肝內具有雙向分化潛能的干細胞可能為CK14和CK19雙陽性細胞，隨后向膽管上皮分化者其CK19表達增強，而CK14表達消失。孕期第79 周，肝門四周門靜脈大分支周圍消失一些對CK8 、CK18 和CK19的免疫反應明顯增強的增殖細胞，在孕期9周以后進化為 膽管極 并逐漸分布于整個肝臟，孕12周時 膽管極 逐漸改建成單個的小葉內膽管，孕20 周以后 膽管極 細胞開頭對CK7 產生免疫反應，意味著這群細胞消失了與正

17、常成人肝內膽管上皮細胞相像的一組多肽。后來的商量也證實了同樣的過程10。因此，通過觀察肝細胞和膽管細胞標記的共同表達，我們可以推測HCC起源于肝臟干細胞或前體細胞/祖細胞11,12。在肝卵圓細胞和造血干細胞上部分表達相同的細胞表面標記，在嚙齒類動物有c-kit、CD34以及Thy-1，在人類共同表達c-kit和CD3413，14。因此有學者推測，至少部分卵圓細胞起源于骨髓干細胞15。肝干細胞可以通過檢測共同表達肝細胞型表面標記(CK18或CK8)、膽管細胞表達膽管型的表面標記(CK19或CK7)以及造血干細胞表面標記(CD34、c-kit)確定1315。c-kit是人類原癌基因，編碼跨膜酪氨酸

18、激酶的受體(CD117)。c-kit主要在肥大細胞、定向造血干細胞、肝干細胞和一些腫瘤細胞中表達。對暴發性肝衰竭和正常肝組織表達肝干細胞因子及其受體(SCF/c-kit)的商量顯示，SCF/c-kit系統的表達與肝損傷后的修復有關，c- kit陽性細胞可能就是肝內特異性干細胞團14。CD34是一種重糖化I型跨膜蛋白，在最早的造血祖細胞上高水平表達，當成熟的血細胞失去形成克隆的能力時，表面表達則減低到檢測不出的水平。CD34在除血竇內皮細胞以外的全部小血管內皮細胞中均表達，且還可以在組織干細胞(如肝干細胞)16，17中表達。肝干細胞表達c-kit和CD34 1416，但是在Hering管細胞中c

19、-kit陽性的細胞CD34呈陰性表達18，其可能是肝細胞的前體細胞/祖細胞。我們通過免疫組化法商量了肝細胞癌中c-kit和CD34的表達。在商量中有45%(9/20)的肝細胞性肝癌表達c-kit，而CD34則無表達。c-kit陽性而CD34無一例陽性提示，HCC可能不是起源于肝干細胞而是來源于過渡性的前體細胞/祖細胞，如來源于Hering管的卵圓細胞。c-kit的表達與血管內皮細胞遷移有關，有可能促進新血管的形成;也有可能增加酪氨酸激酶的活性，導致新生血管的形成而促進腫瘤的生長19。CK7是膽管型細胞角蛋白，通常表達于膽管上皮細胞，而不表達于肝細胞20 ,21，正如本商量所顯示的實驗結果。但是，在肯定病理生理條件下，細胞角蛋白可以發生表達異常22。我們觀察到70%(14/20)的肝細胞性肝癌表達CK7，提示在肝細胞增殖和癌變過程中，細胞表型發生