1、WORD格式從土壤中別離純培養(yǎng)微生物并作初步觀察鑒定實驗報告生物科學與技術(shù)系09食品 2班*： *x學號： *x專業(yè)資料整理WORD格式從土壤中別離純培養(yǎng)微生物并作初步觀察鑒定【摘要】利用別離純化微生物的根本操作技術(shù)對土壤中的微生物進展別離與純化，根據(jù)菌落形態(tài)觀察及一系列的生理生化試驗的結(jié)果，對照種屬特征初步鑒定別離純化的微生物所屬的類群。專業(yè)資料整理WORD格式【關(guān)鍵詞】細菌放線菌霉菌 劃線別離培養(yǎng)基的配制高壓蒸汽滅菌專業(yè)資料整理WORD格式前言：在自然條件下， 微生物常常在各種生態(tài)系統(tǒng)中群居雜聚。群落是不同種類微物的混專業(yè)資料整理WORD格式和體。為了生產(chǎn)和科研的需要，人們往往需要從自然界

2、混雜的微生物群體中別離出具有特殊功能的純種微生物；或重新別離被其他微生物污染或因自發(fā)突變而喪失原有優(yōu)良性狀的菌株；或通過誘變及遺傳改造后選出優(yōu)良性狀的突變株及重組株。這種獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為微生物的別離純化技術(shù)。純培養(yǎng)是指一株菌種或一個培養(yǎng)物中所有的細胞或孢子都是由一個細胞分裂、繁殖而產(chǎn)生的后代。別離純化技術(shù)主要由采集樣品、 富集培養(yǎng)、純種別離和性能測定等幾個根本環(huán)節(jié)組成。實驗目的：1 、學習從土壤中別離、純化微生物的原理與方法。2 、學習、掌握微生物的鑒定方法。3 、對提取的土樣進展微生物別離、 純化培養(yǎng)，根據(jù)菌落的形態(tài)特征判斷未知菌的類別。實驗原理：從混雜的微生物群體中獲得只含有某

3、一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。通過如下幾種方法可以別離純化微生物：稀釋倒平板法 (pour plate method) 、涂布平板法 (spread plate method) 、稀釋搖管法 (dilution shake culture method) 、平板劃線別離法 stesak plate method 。此次實驗采取的是平板別離法，該方法操作簡便，普遍用于微生物的別離與純化，其根本原理主要包括兩個方面：一選擇適合于待別離微生物的生長條件或參加某種抑制劑造成只利于待別離微生物生長，而抑制其它微生物生長的環(huán)境，從而淘汰大部分不需要的微生物。二微生物在固體培養(yǎng)基上生長形成

4、的單個菌落可以是由一個細專業(yè)資料整理WORD格式胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單菌落的方法可通過稀釋涂布平板法或平板劃線法等技術(shù)來完成。微生物的觀察可以用顯微鏡觀察其細胞形態(tài)，也可以用肉眼觀察其菌落形態(tài)。前者是微生物的顯微鏡觀察技術(shù)，后者是微生物的肉眼觀察技術(shù)。1. 實驗器材、試劑與實驗方法：1.1 器材：試管、三角瓶、燒杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、 pH試紙、棉花、牛皮紙、記號筆、線繩、紗布、培養(yǎng)皿、自動立式壓力蒸汽滅菌器、烘箱、玻璃珠、移液槍、槍頭、稱量紙、藥匙、試管架、接種環(huán)、酒精燈、超凈工作臺。1.2 試劑：牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、可溶性淀粉、葡萄糖、

5、孟加拉紅、鏈霉素、1mol/L NaOH、 1mol/LHCl 、 KNO3、NaCl、K2HPO4· 3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、80%乳酸、 10% 酚液、 95%乙醇、 75%酒精。1.3 土樣：取自*師X學院生物科學與技術(shù)系植物園，地下10cm-15cm左右。1.4實驗方法1.4.1 配制培養(yǎng)基：( 一配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基200ml( 用2個100ml三角瓶和 2支試管分裝牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基是一種應用最廣泛和最普遍的細菌根底培養(yǎng)基。專業(yè)資料整理WORD格式配方如下：牛肉膏0.6g蛋白胨 2g NaCl1g瓊脂3 4g水 20

6、0ml pH7.4-7.6專業(yè)資料整理WORD格式1、稱藥品 按實際用量計算后，按配方稱取各種藥品放入大燒杯中。牛肉膏和蛋白胨可分別放在小燒杯或外表皿中稱量，用熱水溶解后倒入大燒杯。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。2、加熱溶解 在燒杯中參加少于所需的水量，然后放在石棉網(wǎng)上，小火加熱，并用玻璃棒攪拌，待藥品完全溶解后再補充水分至所需量。假設配制固體培養(yǎng)基，那么將稱好的瓊脂放入已溶解的藥品中，再加熱融化，在此過程中，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底或溢出，最后補充所失水分。3、調(diào) pH用 pH試紙或酸堿度計檢測培養(yǎng)基的pH值，假設 pH偏酸，可滴加 1mol/L NaoH，邊加邊攪拌，并隨時檢測，直至到達

7、所需pHX圍。假設偏堿，那么用 mol/lHCL進展調(diào)節(jié)。pH調(diào)節(jié)通常放在加瓊脂之前。 注意 pH值不要調(diào)過頭， 以免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。專業(yè)資料整理WORD格式4、過濾 液體培養(yǎng)基可用濾紙過濾，固體培養(yǎng)基可用 4層紗布趁熱過濾，以利結(jié)果的觀察。5、分裝按實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管或三角瓶內(nèi)。分裝時可用三角漏斗以免使培養(yǎng)基沾在管口或瓶口上而造成污染。 分裝量：固體培養(yǎng)基約試管高度的 1/5 ；分裝入三角瓶內(nèi)的以不超過其容積的一半為宜， 半固體培養(yǎng)基以試管高度的 1/3 為宜。6、加棉塞 試管口和三角瓶口塞上用普通棉花非脫脂棉制作的棉塞。棉塞的形狀、大小和松緊度要適合，四周

8、緊貼管壁，不留縫隙，才能起到防止雜菌侵入和有利通氣的作用。要使棉塞總長 3/5 塞入試管口或瓶口內(nèi)，以防止棉花脫落。有些微生物需要更好的通氣，那么可用 8層紗布制成通氣塞。有時也可用試管帽或塑料塞代替棉塞。7、包扎加塞后，將三角瓶的棉花外包一層牛皮紙或雙層報紙，以防止滅菌時冷凝水沾濕棉塞。假設培養(yǎng)基分裝于試管中，那么應先把裝同類培養(yǎng)基的試管扎成捆后，再于棉花塞外一層牛皮紙。然后用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、組別、日期。8、滅菌 將上述培養(yǎng)基于 121.3 攝氏度濕熱滅菌 20min。如因特殊情況不能及時滅菌，那么應放入冰箱內(nèi)暫存。9、擺斜面 滅菌后，如制斜面，那么需趁熱將試管口端擱在一根長木條上，并

9、調(diào)整斜度，使斜面的長度不超過試管總長的 1/2 ；待其凝固，10、無菌檢查 將滅菌的培養(yǎng)基放入 37攝氏度溫箱中培養(yǎng) 24-48h ，無菌生長即可使用。或儲存于冰箱或清潔的櫥內(nèi)，備用。( 二配制高氏一號瓊脂培養(yǎng)基200ml( 用1個100ml三角瓶和 2支試管分裝高氏一號培養(yǎng)基是用于別離和培養(yǎng)放線菌的合成培養(yǎng)基。配方如下：可溶性淀粉 4g，KNO30.2g ，NaCl 0.1g,K 2 HPO4.3H2O0.1g, FeSO4.7H2O0.002g, 瓊脂 34g, 水200mL, pH7.47.6 。1、稱量和溶解 先計算后稱量 , 按用量先稱取可溶性淀粉 , 放入小燒杯中 , 并用少量冷水

10、將其調(diào)成糊狀 , 再加至少于所需水量的沸水中 , 繼續(xù)加熱 , 邊加熱邊攪拌 , 至其完全溶解 . 對微量成分 eSO4.7H2O可先配制成高濃度的儲藏液后再參加 , 方法是先在 100 ml 水中參加 1g的 eSO4.7H2O,配成 0.01mg/ml 的儲藏液 , 再在 200 ml的培養(yǎng)基中參加以上儲藏液 0.02 ml即可 . 待所有的藥品完全溶解后 , 補充水分到所需的總體積 . 如果要配制固體培養(yǎng)基 , 其瓊脂溶解過程同牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配制 .2、pH 調(diào)節(jié) 分裝 包扎 滅菌及無菌檢查同上一專業(yè)資料整理WORD格式三配制馬丁氏培養(yǎng)基 200ml( 用 1個 100ml三角瓶和

11、2支試管分裝.馬丁氏培養(yǎng)基是用于別離真菌的選擇培養(yǎng)基。配方如下： K 2HPO40.2g ，MgSO47H2O0.1g,蛋白胨 1g,葡萄糖 2g, 瓊脂 34g, 水200mL，自然 pH1、稱量和溶解先計算后稱量，按用量稱取各成分，并將其溶解在少于所需水量的水中。待各成分溶解后，補充水分至所需體積。再將孟加拉紅配成1%的水溶液，在200 ml 的培養(yǎng)基中參加以上孟加拉紅溶液 0.66ml ，混勻后，再參加瓊脂參加融化，方法同一2 、同二 23、鏈霉素的參加鏈霉素受熱容易分解，所以臨用時，將培養(yǎng)基融化待其溫度降至45攝氏度左右時才能參加。 可先將鏈霉素配成 1%的溶液配好的鏈霉素溶液保存于

12、-20 攝氏度，在 100ml培養(yǎng)基中參加 1%鏈霉素 0.3ml, 使每毫升培養(yǎng)基中含鏈霉素 30ug。1.4.2制備土壤稀釋液：1、取土壤取表層以下 510cm處的土壤樣品，放入滅菌的袋中備用，或放在 4oC 冰箱暫存。2、制備稀釋液要無菌操作（ 1制備土壤懸液：取土樣 0.5g ，迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中玻璃珠用量以充滿瓶底為最好，振蕩 510min，使土樣充分打散，即成 10-2的土壤懸液。（ 2稀釋：用無菌移液管吸 10-2的土壤懸液 0.5mL, 放入 4.5m 無菌水中 , 即為 10-3稀釋液，如此重復，可依次制成 10-3 10-7的稀釋液。注意：操作時管尖不能接觸液面，

13、每一個稀釋度換一支移液管，每次吸土液，要將移液管插在液面，吹吸 3次，每次吸上的液面要高于前一次，以減少稀釋中的誤差。示意圖如下：0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml10-210-310-410-510-610-7稀釋過程示意圖專業(yè)資料整理WORD格式圖中左側(cè)梯形為三角瓶，其中參加49.5ml 無菌水與 0.5g 土樣，土壤溶液稀釋度為10-2依此類推，右側(cè)三試管中土壤稀釋度分別為：10 -3、 10-4、 10-5、 10-6、 10-71.4.3混菌測定菌落數(shù)的方法1細菌取 10-6 ， 10-7兩管稀釋液各 1ml，分別接入相應標號的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。然后取冷卻

14、至50的牛肉膏瓊脂培養(yǎng)基，分別倒入以上培養(yǎng)皿中裝量以鋪滿皿底的 2/3 為宜，迅速輕輕搖動平皿，使菌液與培養(yǎng)基充分混均，但不沾濕皿的邊緣，待瓊脂凝固即成細菌平板，倒平板時注意無菌操作。2放線菌取10-3 、10-4 兩管稀釋液，在每管中參加10%酚液 56滴，搖勻，靜置片刻，然后分別從兩管吸出 1ml參加相應標號的平皿中，選用高氏1號培養(yǎng)基，用與細菌一樣的方法倒入平皿中，便可制成放線菌平板。3霉菌取 10-2 、10-3 兩管稀釋液各 1ml，分別接入相應的平皿中，每個稀釋度接兩個平皿。在熔好的馬丁氏固體培養(yǎng)基中，每 100ml參加滅菌的乳酸 1ml，輕輕搖勻，然后用與細菌一樣的方法倒入平皿中

15、，便可制成霉菌平板。4酵母菌在 3即可能別離到。1.4.4 培養(yǎng)將接種好的細菌、放線菌、霉菌平板倒置，即皿蓋朝下放置，于2830oC 恒溫培養(yǎng)，細菌培養(yǎng) 12d，放線菌培養(yǎng)57d，霉菌 35d。可用于觀察菌落，用于進一步純化別離或直接轉(zhuǎn)接斜面。1.4.5平板劃線別離微生物1 、倒平板 按無菌操作要求， 在干凈工作臺或在火焰旁操作， 取融化并冷卻至不燙手的固體培養(yǎng)基 約 50oC，倒入無菌培養(yǎng)皿， 倒量以鋪滿皿底為限， 平放待其冷卻凝固，備用。2 、劃線別離 使用接種環(huán)，從待純化的菌落或待別離的斜面菌種中沾取少量菌樣，在相應培養(yǎng)基平板劃線別離如圖 ，劃線的方法多樣，目的是獲得單個菌落。專業(yè)資料整

16、理WORD格式3 、培養(yǎng)方法同“土壤稀釋別離 。4、菌落觀察從培養(yǎng)好的未知平板中，挑選8 個不同的單菌落，逐個編號，根據(jù)菌落識別要點區(qū)分未知菌落類群，并將觀察結(jié)果填入表4-1 。1.4.6 斜面接種1、取新鮮固體斜面培養(yǎng)基，分別做好標記寫上菌名，日期、接種人等，然后用無菌操作方法，把待接菌種接入以上培養(yǎng)基斜面中。2、接種方法用接種環(huán)沾取少量待接菌種，然后在新鮮斜面上“之字形劃如圖，方向是從下部開場，一直劃至上部。注意劃線要輕，不可把培養(yǎng)基劃破。3、接種后恒溫培養(yǎng) 同 1.4.4 。2. 試驗結(jié)果與討論從實驗結(jié)果中可以推斷出土壤中別離的微生物的種類，根據(jù)菌落數(shù)判斷土壤中微生物的含量， 實驗過程中

17、很多沒注意的事項， 可能影響實驗結(jié)果的正確性。2.1 實驗的結(jié)果區(qū)分和識別各大類微生物通常不外乎包括菌落形態(tài)群體形態(tài)和細胞形態(tài)個體形成等兩方面的觀察。 細胞的形態(tài)構(gòu)造是群體形態(tài)的根底， 群體形態(tài)那么是無數(shù)細胞形態(tài)的集中反映，故每一大類微生物都有一定的菌落特征， 即它們在形態(tài)大小、 色澤透明度、 致密度和邊緣等特征上都有所差異，一般根據(jù)這些差異就能識別大局部菌落。一菌落數(shù)觀察記錄表天第一天第二天第三天第四天第五天第六天專業(yè)資料整理WORD格式培養(yǎng)基數(shù)濃度專業(yè)資料整理WORD格式10-2172324313037345541644586馬丁氏專業(yè)資料整理WORD格式高氏一號牛肉膏蛋白胨-31010-

18、410-510-610-7121932244342735495731663245486763897499981671272081462716372448306457818322332354785910711128138235124829543369407142專業(yè)資料整理WORD格式二未知菌落的形態(tài)觀察記錄表濕干菌落描述菌培隆顏透判斷落養(yǎng)色厚大松大表邊起明結(jié)果號基薄小密小面緣形正反水溶性度狀面面色素1牛肉膏薄小光滑整齊凝膠淡淡無半透細菌蛋白胨2濕潤狀黃黃明3高氏 1號致枯燥顆粒乳乳不透放線厚大密小多皺絨狀狀白白無明菌45馬丁氏較較疏大枯燥地毯低凹淺粉無不透霉菌厚大松粗糙狀紅紅明6四大類微生物菌

19、落的根本特征專業(yè)資料整理WORD格式菌落形態(tài)細菌酵母菌放線菌霉菌菌落外表濕潤，薄而小菌落外表濕潤，厚而大菌落外表枯燥，密而小菌落外表枯燥，松而大專業(yè)資料整理WORD格式附加說明：1. 三根試管中的菌形態(tài)特征比較明顯，能夠識別區(qū)分，霉菌菌苔枯燥，較松，所以外表粗糙；細菌菌苔濕潤，外表光滑，整體扁平，呈較透明狀態(tài)；放線菌菌苔較枯燥，長得較致密。2. 倒平板時，時間的掌控至關(guān)重要，操作過慢將導致局部培養(yǎng)基先凝固，平板不平。3. 劃線時組員應待培養(yǎng)基凝固后劃線，否那么局部平板會被劃破；隨著實驗的進展，組員劃線有所進步。4. 斜面接種：接種環(huán)較細，力度各方面較難把握。操作時，應盡量細心，小心的操作。專業(yè)

20、資料整理WORD格式2.2討論2.2.1實驗可靠性分析：由于一些實驗操作細節(jié)處理不當，實驗的結(jié)果可能存在一些誤差。但總體上實驗的結(jié)果還是具有一定可靠性的。2.2.2 、本卷須知：1、稱藥品后應做好標志，勿與其它藥品混在一起；稱完藥品應及時蓋緊瓶蓋。2、注意 pH值不要調(diào)過頭，以免影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。3、使用高壓滅菌鍋應嚴格按照操作程序加水、排冷空氣、降零進展，防止發(fā)生事故；滅菌時操作者切勿擅自離開。4、應用記號筆在相應位置注明培養(yǎng)基的名稱、組別、日期。5、干熱滅菌時消毒箱中物品不要擺得太擁擠，以免阻礙空氣流通而影響滅菌效果；滅菌物品不要與消毒箱內(nèi)壁的鋼板接觸，以防包裝紙烤焦起火。6、倒平

21、板時時間要掌握好，防止培養(yǎng)基凝固，并且倒完后應當輕輕搖動平板兩圈，使平板夠平；待培養(yǎng)基凝固后劃線，力度要適當，盡量不要將培養(yǎng)基劃破。7、接種時，應盡量挑取生長較好，比較純的。8、在接種時候應先用酒精燈將接種環(huán)前面的鉑絲燒紅，即對其進展滅菌；待溫度降下來之后再接種。每次接種完后，要進展下一次接種之前，都要采取同樣的方式。9、應即時對試管和平板進展觀察，并做相應的記錄。10、一般土壤中，細菌最多，放線菌和霉菌次之， 而酵母菌主要見于果園和菜園土壤中，故從土壤別離細菌時應取較高的稀釋度，否那么菌落將連成一片而不能計數(shù)。11、放線菌的生長時間比較長，故制作平板時，培養(yǎng)基的量應多加一點。12、觀察菌落特點時應選擇別離的較開的很大的菌落，對培養(yǎng)基和試管要編好，不要隨意移動開蓋，以免搞混菌號或受到污染。13、實驗完成后，應對實驗數(shù)據(jù)的收集、處理和篩選。認真比對分析并作好記錄，通過教師的指導及查閱相關(guān)文獻對數(shù)據(jù)進展正確的篩選和整理，最終得到實驗結(jié)果。2.2.3心得體會：（ 1通過實驗我們學習了微生物實驗中較根本的操作技能，掌握了配置培養(yǎng)基的一般方法和步驟、從土壤中別離微生物的方法，對無菌操作技術(shù)有了一定的了解，同時使組員的合作更加高效、密切。（ 2在做關(guān)于別離實驗時，無菌操作特別重要。因操作不當很容易感染，使所做的平板或斜面失敗，故操作前應先對所要使用的物品進展紫外線滅菌，