1、 微生物的計數血球計數板法【摘要】測定微生物細胞數量的方法很多，有分光光度法、顯微直接計數法和平板計數法。分光光度法比較簡便，易操作，但是會使數據嚴重偏大。而平板計數法則會使實驗數據嚴重偏小。 顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫霍澤（Petrof Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。本實驗采用血球計數板法，主要目的是了解血球計數板法的構造和使用方法，學會用血球計數板對酵母菌

2、細胞進行計數。一、實驗目的與要求 1、了解微生物計數常用的三種方法：分光光度法；平板計數法；血球計數板法。2、了解血球計數板的構造和使用方法。3、學會用血球計數板對酵母細胞進行計數。二、基本原理利用血球計數板在顯微鏡下直接計數，是一種常用的微生物計數方法。此法的優點是直觀、快速。將經過適當稀釋的菌懸液（或孢子懸液）放在血球計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由于計數室的容積是一定的（0.1mm2），所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微生物數目來換算成單位體積的微生物總數目。由于此法計得的是活菌體和死菌體的總和，故又稱為總菌計數法。血球計數板，通常是一塊特制的載玻片，其上由四條槽

3、構成三個平臺。中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網，每個方格網共分九個大方格，中間的大方格即為計數室，微生物的計數就在計數室中進行。 計數室的刻度一般有兩種規格，一種是一個大方格分成16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但無論是哪種規格的計數板，每一個大方格中的小方格數都是相同的，即1625=400小方格。 每一個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，蓋上蓋玻片后，載玻片與蓋玻片之間的高度為01mm，所以計數室的容積為01mm3。在計數時，通常數五個中方格的總菌數，然后求得每個中方

4、格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數，然后再換算成1ml菌液中的總菌數。下面以一個大方格有25個中方格的計數板為例進行計算：設五個中方格中總菌數為A，菌液稀釋倍數為B，那么，一個大方格中的總菌數因1ml=1cm3=1000mm3， =50000AB（個）同理，如果是16個中方格的計數板，設五個中方格的總菌數為A，則三、實驗材料1）菌種：釀酒酵母菌2）用品：顯微鏡、血球計數板、酒精燈、蓋玻片、接種環、番紅染液、膠頭滴管。四、實驗方法 1、實驗流程圖 制備稀釋液加樣找計數室計數2、實驗步驟1）鏡檢計數室：在加樣前，先對計數板的計數室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數。

5、2）將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。 3)取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。然后在顯微鏡下找到計數室。若計數室沾有雜質或者菌體，要用蒸餾水沖洗計數板，用濾紙吸干其上的水分。然后再放到顯微鏡下找到計數室。 4)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面力充滿計數區，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。 5)靜置片刻，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應減弱光照的強度。 6)計數時若計數區是由16個大方格組

6、成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央l個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。本實驗采用25格16格的血球計數板。計數時應數5個大方格。 7)計數。每個樣品重復計數23次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。 8)測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入

7、盒保存。 9）計算結果。 可用以下公式進行計算（1）16格25格的血球計數板計算公式：細胞數/ml=100小格細胞個數/10040010000稀釋倍數（2）25格16格的血球計數板計算公式：細胞數/ml=80小格細胞個數/8040010000稀釋倍數5、 實驗結果計算次數各大格中細胞數大格中細胞總數稀釋倍數總菌數（CFU/mL或g)左上右上左下右下中間第一次3237403944960100960000000六、結論與分析1、誤差來源本次試驗中我們組用的是2號酵母培養液，是本次試驗所用的酵母培養液中濃度最高的培養液。但是經過老師分析，實驗數據仍然偏大的一點。產生這種誤差的原因大概如下：酵母細胞計

8、數的誤差分別來源于技術誤差和固有誤差。其中由于操作人員不注意細節，器材處理、使用不當，稀釋不準確，細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差；而由于儀器（計數板、蓋片、吸管等）不夠準確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細胞分布不均勻等因素帶來的細胞計數誤差屬于分布誤差或計數域誤差（filederror）。由于時間的關系，實驗計數的次數太少，難以得到準確均勻的實驗數據。在實驗過程中，操作人員也存在一定的不嚴謹性，導致實驗結果產生誤差。由于沒有足夠多的平行數據，難以用科學的計數方法進行結果的計算，因此難以得到比較準確的實驗數據。 因此，搞好酵母細胞計數的質量控制一般需采用以下措施。1）避免技術誤差，糾

9、正儀器誤差所用器材均應清潔干燥，計數板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規格應符合要求或經過校正。嚴格操作，從消毒、稀釋、加樣到計數都應規，尤其應注意的是樣品稀釋要作到充分混勻。必須一次性充滿計數室，防止產生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數室臺面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。2）縮小計數域誤差或分布誤差由于血細胞在充入計數室后呈隨機分布或，而我們所能計數的細胞分布圍是有限的，由此造成的計數誤差稱為計數域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴大細胞計數圍和計數數目，一般先進行誤差估計，然后決定所需計數的數目和計數圍，只要能將誤差控制在允許圍即可。2、不足之處 血球計數板在顯微鏡下直接進行測定。它觀察在一定的容積中的微生物的個體數目，然后推算出含菌數，簡便快捷。但是在計數時包括死活細胞均被計算在，還有微小雜物也被計算在。這樣得出結果往往偏高，因此適用于對形態個體較大的菌體或孢子進行計數。7、 思考題1、試述血球計數板的計數原理。為什么用兩種規格不同的計數板計數同一樣品，結果是一樣的？ 答：每塊計數板由H形凹槽分為2個同樣的計數池 計數池兩側各有一支持柱，將特制的專用蓋玻片覆蓋其上，形成高0.10mm的計數池。計數池畫有長、寬各3.0mm的方格，分為9個大方格，每個大格面積為1.0mm;.容積為0.1mm，中央大方格用雙線分成25個中方格，位于正中及四角5個中方格是紅細胞