1、RNAi 沉默 COX-2對(duì) HSC細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及脂質(zhì)代謝的影響第一章 COX-2基因 shRNA干擾載體的構(gòu)建及抗肝纖維化作用目的構(gòu)建COX-2shRNA真核表達(dá)載體，并觀察其抗肝纖維化作用。 方法 1. 分別從 TRCshRNA、origeneshRNA數(shù)據(jù)庫(kù)中選取 1 條大鼠 COX2基因及 2 條人 COX2基因序列，分別構(gòu)建 3 個(gè) COX-2ShRNA真核表達(dá)載體，進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序；2. 脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HSC-T6細(xì)胞株 , 熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測(cè) COX-2mRNA表達(dá) ,Western-Blot檢測(cè) COX-2蛋白質(zhì)表達(dá)； 3.SD 大鼠尾靜脈注射腺

2、病毒介導(dǎo)的重組質(zhì)粒體內(nèi)轉(zhuǎn)染； 12 周末 , 處死大鼠； RT-PCR檢測(cè)肝組織 COX-2mRNA表達(dá) , 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織COX-2蛋白質(zhì)表達(dá) , HE、MASSON染色分析纖維病變程度 , 圖像分析儀測(cè)量肝組織纖維病變面積。結(jié)果1. 酶切、測(cè)序、比對(duì)顯示，COX2-shRNA-1,2,3序列成功插入目的載體，且序列完全正確；2. 熒光顯微鏡觀察顯示 COX-2shRNA1、COX-2shRNA2、 COX-2shRNA3轉(zhuǎn)染效率均在 70%以上；3.RT-PCR和 Western-Blot檢測(cè)證實(shí) , 轉(zhuǎn)染后 COX-2shRNA1,2,3均可抑制 HSC-T6細(xì)胞株 COX-2基

3、因的表達(dá) , 但抑制程度不一 , 其中 COX-2shRNA-1組抑制作用最明顯； 4. COX-2shRNA-1SD大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染 , RT-PCR 和免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí) ,COX-2shRNA1可抑制 COX-2基因表達(dá)及纖維化組織增生。結(jié)論 1. 成功構(gòu)建 COX-2基因 shRNA干擾載體； 2. COX-2shRNA1，2，3 具有抑制 HSC-T6細(xì)胞 COX-2表達(dá)作用，其中COX-2shRNA-1抑制作用最為明顯； 3.COX-2shRNA1具有抑制 SD大鼠肝組織 COX-2表達(dá)的作用； 4. COX-2shRNA1具有抑制 SD大鼠肝纖維化作用。第二章 RNAi 沉默 CO

4、X-2對(duì) HSC基因表達(dá)譜的影響目的研究 COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞COX-2后，HSC基因表達(dá)譜的變化。 方法 1.實(shí)驗(yàn)分為 COX-2shRNA1組、HK組（空載體組）；2.Trizol法提取 HSC中的總 RNA。純化 mRNA,兩組 mRNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成熒光標(biāo)記的cDNA混合物探針； 3. 熒光標(biāo)記的 cDNA混合物探針，與 27K Rat Genome Array 雜交，經(jīng)嚴(yán)格洗片后，用GenePix40OOB掃描儀掃描芯片熒光信號(hào)圖像，計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理，將所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較， 得到二者間基因表達(dá)的差異信息。結(jié)果 1. 按 Ratio 值 1.5 和0.667 標(biāo)準(zhǔn) ,

5、 沉默 COX-248小時(shí)、 72 小時(shí)后， HSC分別有 45 個(gè)和 93 個(gè)基因出現(xiàn)差異性表達(dá)； 2. 按 Ratio 值 2.0 和 0.5 標(biāo)準(zhǔn) , 沉默 COX-248小時(shí)、72 小時(shí)后，HSC分別有 12 個(gè)和 23 個(gè)基因出現(xiàn)差異性表達(dá)； 3. 沉默 COX-2后 , HSC-T6差異表達(dá)基因主要與生物學(xué)過(guò)程（48 小時(shí)、 72 小時(shí)分別為 54.32%,44.29%）、分子功能（ 48 小時(shí)、 72 小時(shí)分別為 32.10%，37.14%）有關(guān)。結(jié)論 1. COX-2shRNA1沉默COX-2后 HSC基因表達(dá)譜發(fā)生變化； 2. COX-2shRNA1沉默 COX-2后差異表達(dá)

6、基因主要與生物學(xué)過(guò)程、分子功能有關(guān)。目的研究 COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞COX-2后，肝星狀細(xì)胞脂肪代謝的變化 , 驗(yàn)證基因芯片篩選的與脂代謝密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。第三章RNAi 沉默COX-2對(duì) HSC細(xì)胞動(dòng)力學(xué)及相關(guān)基因表達(dá)的影響目的研究COX-2shRNA1沉默肝星狀細(xì)胞 COX-2后，肝星狀細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的變化, 驗(yàn)證基因芯片篩選的與細(xì)胞動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。方法 1.MTT法檢測(cè)細(xì)胞體外增殖活力；2. 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HSC-T6凋亡及細(xì)胞周期； 3.RT-PCR法和 Western blot 法驗(yàn)證細(xì)胞動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)的差異表達(dá)基因。結(jié)果 1. 與空白對(duì)

7、照組（ NC）和空載體（ HK）組相比，轉(zhuǎn)染pYr-1.1-hU6-EGFP-COX2-shRNA1質(zhì)粒， 48h 細(xì)胞凋亡率明顯增加 (P <0.01)；2.72h 后 HSC-T6細(xì)胞的增殖出現(xiàn)明顯的抑制作用(P<0.05)； 3. COX-2shRNA1組 G1%相較 NC組和 HK組的 G1%增高；4.RT-PCR驗(yàn)證顯示 Cdc27、Sh3kbp1 表達(dá)增加 , Plcd4表達(dá)減弱 , 其余統(tǒng)學(xué)處理沒(méi)有顯著意義。結(jié)論1.COX-2shRNA1能夠抑制 HSC-T6細(xì)胞體外增殖；2.COX-2shRNA1能夠促進(jìn) HSC-T6凋亡；3.COX2ShRNA1可

8、能在 G0/G1期阻滯細(xì)胞周期； 4. RT-PCR驗(yàn)證顯示 Cdc27、Sh3kbp1 表達(dá)增加 ,Plcd4 表達(dá)減弱。方法1. 高效液相色譜法（ HPLC）檢測(cè) 24 小時(shí)、 48 小時(shí)、 72小時(shí)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯、膽固醇、維生素A 含量； 2.RT-PCR檢查驗(yàn)證脂代謝差異表達(dá)基因。結(jié)果 1.COX-2ShRNA1組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加（ F=34.524,P=0.000 ）, 各時(shí)間段的空載體組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量存在顯著差異 （均 P<0.05 ）；2.COX-2ShRNA1組細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低 （F=360.808,P=0.000 ）, 與各時(shí)間段的空載體組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量存在顯著差異（均 P<0.05 ）；3.COX-2ShRNA1組細(xì)胞內(nèi)維生素A 的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加（F=19346.057,P=0.000 ）,各時(shí)間段的空載體組與空白對(duì)照組比較，細(xì)胞內(nèi)維生素 A 含量存在顯著差異 （均P<0.05）；4. R