1、精選優質文檔-傾情為你奉上1. 題目：擬南芥干旱脅迫的分子和生理分析揭示了植物生長對環境適應的初期反應2. 背景知識：對由土壤水分虧缺引起的干旱，植物會表現出一系列的抗旱機制，進一步把這些抵抗行為分為干旱逃避和耐干旱兩種。干旱逃避是植物整個生長發育過程不與干旱相遇逃避干旱危害，即在干旱來臨前完成生命周期的能力；或植物具有防御干旱的能力，以抵御干旱對植物的有害影響，使植物在干旱下仍能維持正常的生理狀態（逆境排外）。耐干旱是在植物組織低水勢下抵抗水分虧缺的能力，植物可以通過代謝反應阻止、降低或修復由逆境造成的損傷，使其在逆境下仍保持正常的生理活動。3.用來檢驗植物的耐受性和抗性反應的干旱處理方法有

2、很多種：累積干旱（pDr）即水分被抑制一段時間直到可以觀察到萎焉癥.這種干旱處理方法通常用來確定存活率或檢測基因表達的變化。 然而，累積干旱（pDr）處理的一個缺點是，由于土壤水分濕度不能控制，它不能用來比較不同生長特性下不同基因型的行為功能。為了模擬田間條件和量化干旱反應，可以利用以下方法：可控制的干旱處理，就是使植物處于土壤水分虧缺的恒定水平，對植物非致死干旱反應的基因型和生態型進行評估。4.材料與方法1.生長條件和干旱處理將擬南芥生態型（哥倫比亞）種子播于濕潤的泥炭團中，分層的在4放置2天，然后轉移至2210小時光照(100 mole m-2 s-1)的培養室里。實驗的最開始，對做干旱處

3、理的泥炭團在播種之前進行稱重以確定泥炭團里的水分含量。可控制的中等干旱條件(mDr)是給植物田間持水量的30%，即200%或每克干土壤含2克水。5. 為了做到這點，制作了一個半自動的系統：一個天平連接在計算機上利用軟件來操作，軟件使輸入的重量直接進入Excel系統，Excel軟件運用一系列的方程計算每個稱量的泥炭團中的含水量，最終需水量，所需加水量。每天都需要對泥炭團進行稱量，通過計算補充水分，使其維持在田間蓄水量的30%即mDr水平。本實驗分為三組：第一組播種后（DAS）25天進行上述處理，第二組播種30天后處理，第三組播種35天后處理。同時三組植物分別表現為 ：8片葉子10片葉子、12片葉

4、子。6. 對累積水分虧缺（pDr）處理，植物也是在上述培養室中培養，播種后35天不給于水分，泥炭團保持干燥，通過稱量泥炭團的重量使其達到所需要的累積水分虧缺水平（pDr）。在這項研究中進行兩個水平上的測定：萎焉水平和萎焉前一天（萎焉前水平）.7. 2.植物生長期生長率的測定如上所述，植物在正常生長條件下生長，然后采摘不同時期的植物測其生物量。第一組播種后25天采摘，第二組播種后30天采摘，第三組播種后35天采摘。這些日期不像上面所述的干旱處理的時間，而是收獲的真正時間。兩個不同發育時期的生長率：播種后25-30天和播種后30-35天，利用公式計算：相對生長率（RGR）=(lnW2-lnW1)/

5、(t2-t1)生長率通過生物量和葉面積來測定。葉面積,通過掃描干旱處理和水分充足條件下的葉子利用J圖像來測定。通過計算相對膨脹率來描述生物量。8. 3.中等干旱條件下的脫落酸和JA突變體在我們的中等干旱條件下可以檢測到脫落酸缺乏和JA突變體的信號。本實驗用到的突變體有abi1 (SALK_C),蛋白磷酸化酶，引起對ABA不敏感的顯性突變coi1 (SALK_C),對響應茉莉酮酸酯類是必須的jin1 (SALK_C), jar1 (CS8072) in Col background, 腺苷酸形成酶，abi1 (CS22), aba1 (CS21) in Ler background玉米黃質環氧化

6、酶，玉米黃質到紫黃質的環氧化，ABA合成的第一步4.氣體交換測定在中等干旱條件下對五個時間點進行測定：中等干旱 (mDr) 處理的-1, 0 ,1 ,2, 3天。氣體交換的測定在氣體流動率為150 mole s-1, CO2 400 mole,濕度為 50%.的條件下用LICOR 6400XT和擬南芥擴展室來測定。9. 5.生化分析干旱條件和水分充足條件下植物進行淀粉分析，對植物在以下不同的時間點采樣：干旱處理（）的，天水分充足的采樣時間點同上。采樣在傍晚淀粉積累量達到最高值時進行.采樣后將其保存在。將每個樣本在液氮中研磨成良好的粉末，稱重，然后利用酶染色淀粉試劑盒對每個樣本進行定量分析。脫落

7、酸的量化即在以下不同的時間點采樣：中等干旱處理的 第0， 1 ，2天。脯氨酸在中等干旱條件下第3,4天取樣，用上述方法進行量化.10. 6.基因表達模式分析7.擬南芥后基因芯片基因探針圖譜分析8.啟動子分析9.基因功能富集分析10.利用qRT-PCR進行基因表達分析11植物對適度干旱（mDr）的時間性反應為了研究擬南芥對可控制的土壤水分虧缺性干旱反應，在不同的植物發育時期測定適度干旱（mDr）效果（見圖1）。根據控制植物水分的生長時期不同分為三類：播種后25天、播種后30天、播種后35天。這些生長時期相當于在擬南芥的6-葉期、8-葉期、10-葉期停止給植物澆水。12圖2顯示了適度干旱（mDr）

8、處理和水分充足條件相比，最高的生物相對減少率是在播種后30天進行干旱處理的植物，播種后25天進行干旱處理的也很明顯，播種后35天進行干旱處理對干旱的反應最不敏感（圖2A）。擬南芥生態型哥倫比亞植物的生長速率由兩個發育時期決定的：播種后25-30天和播種后30-35天。植物的生長速率（生物量和葉面積）在第一發育階段即播種后25-30天比第二發育階段播種后30-35天高些。（圖2B）由圖可以看出干物質積累和葉片擴張明顯減慢，生長明顯受阻。RB：生物量的相對減少率RGR:相對生長率RER：相對膨脹率DAS：播種后的天數13LRWC(葉片相對含水量) SWC（土壤含水量） DMD（mDr的處理時間）

9、WW （充足水分條件）DRT（干旱條件） 在每個時間點測定植物樣本和土壤中的相對含水量（圖2C和D）。14葉子的相對含水量（LRWC）的測量值顯示植物在mDr處理前1天開始感知干旱（圖2C）.在mDr的第0天（mDr的開始）葉子的相對含水量（LRWC）減少，一直持續到適度干旱處理后1天（圖2C和D）。然而，在適度干旱處理后第2天葉子相對含水量（LRWC）開始增加到水分充足條件的正常水平（圖2C），土壤含水量從mDr處理后第1天開始直到mDr處理的最后一直保持恒定不變（圖2D）。15激素途徑突變體的干旱反應在mDr條件下，敲除ABA信號傳送和生物合成反應的基因的突變體在兩組擬南芥中被測定。在可控

10、制的適度干旱（mDr）條件下和水分充足的條件下相比，生長的減少量（測定的生物量）為不同的基因型和野生型相比較提供了一個參數，辨別出了對干旱敏感/有抗性的變異的基因型。生物量的相對低減率（RB）=（BDRT）/Bww Bww是充足水分條件下生物量；BDRT是中等干旱條件下生物量。16 RB(生物量的相對減少率) WW（充足水分條件） DRT（干旱處理條件） WT（野生型）ABA信號發送突變體（abil）和生物合成突變體（abal）和各自的野生型相比對干旱脅迫更敏感（圖3A.B）。17茉莉酸反應突變體coil和jinl在mDr處理的第10天顯示了顯著的干旱抗性（圖3C和D）。其它茉莉酸反應突變體j

11、arl顯示了干旱反應表現型但和野生型沒有顯著的差異。這種茉莉酸突變體的反應和coil和jinl相比更加緩和，可能是因為jarl的等位基因并沒有完全敲除而是一種氨基酸置換的突變體.18對mDr反應的氣體交換參數的改變Pn：光合作用gs：氣孔導度Ci：內部CO2濃度WW：充足水分條件19在mDr處理后第1天氣孔電導率下降至水分充足條件下的59%（圖4A）。在mDr處理前1天和處理的當天氣孔電導率降低將近50%（圖4A），并且會繼續下降直到mDr處理后第2天，大約降低水分充足條件下的40%。在mDr處理后第3天氣孔電導率會增加到水分充足水平。內部CO2濃度也表現出同樣的趨勢（圖4A）然而光合作用表現

12、了不同的趨勢，mDr處理后第1天沒有下降，第2天和水分充足條件的相比下降了10%（圖4A）.20在mDr處理后第1和第2天瞬時水分利用率（WUEi）比水分充足條件下高（圖4B），在mDr處理后第1和第2天高于4mol mmol-1而水分充足條件下瞬間水分利用率大約為2mol mmol-1，在-1,0,3瞬間水分利用率和水分充足條件下相同。（圖4B）WUEi：瞬時水分利用效率WW:充足水分條件DRT:干旱處理條件DMD:中度干旱處理時間21. 植物對土壤水分虧缺的轉錄應答反應的描述為了了解干旱脅迫下基因表達的整體效應，以mDr(第1天和第10天)和累積干旱條件下的小葉片為材料進行了微序列（基因芯

13、片）分析。不同的表達分析顯示了在對mDr反應的早期（mDr處理后第1天）很多基因（2039個）都受到了顯著地擾亂。然而，在中等干旱脅迫持續了一段時期后（第10天）明顯較少的基因（728個）表現出一些反應。通過這些反應相對比，對累積干旱(pDr即萎焉)的反應中基因表達受到了嚴重的而影響：7648種差異性表達（DE）基因-大約占基因組的30%-全都是已知的壓力反應基因和程序。22. 首先在基因水平進行這三種反應（mDr處理后第1天，第10天，pDr）的比較（圖5）。mDr和pDr處理有178個共同的差異性表達基因（91個上調，87個下調）而mDr處理中有1083個特異的基因（545個上調，538個

14、下調）。23. 在mDr處理后第1天和pDr處理中的上調基因是主要的水分缺失反應基因（q-值1E-15），對ABA刺激(q1E-12.6), 滲透壓(q1E-8.1),寒冷(q1E-4.1)和氧化(q1E-2.5)的壓力反應的重疊基因。這些基因中其中幾個表達動力學已通過qRT-PCR技術被證實。在mDr處理后第1天和pDr的材料中我們已知的被干旱影響的細胞的基本過程包括DNA包裝（q1E2.6）,核糖體的生源（q1E-2.9）和蛋白質折疊（q1E-3.2）都被下調。因此，植物具有對mDr的早期反應和對累積水分虧缺的經典反應是相似的。但是，嚴重的影響包括光合作用基因(q1E-20.7)下調及相關

15、過程僅限于pDr。24. 大部分典型的水分虧缺反應的基因表達在mDr處理后第1天和pDr條件下是上調的，在相似的控制條件下，隨著植物生長到持續mDr的第10天其中一些基因甚至被下調（q1E-2.8）。這些急劇變化的反應很可能是因為植物對持續壓力的適應。在這個階段中，這些上調的基因中有幾個激素（ABA）介導的信號發送基因（q1E-2.1），這些基因可能介導了對環境的適應。硫配糖體（q1E-4）,IAA-衍生物（q1E-2.9），JA(q1E-2.8)和特定的長鏈脂肪酸（q1E-2）的新陳代謝基因在mDr處理后第10天都是下調基因。細胞壁增厚涉及到的一些基因（q1E-2.9）和少數調節細胞生長的基

16、因（q1E-2.8）只有在mDr處理后第10天和mDr Day10-pDr條件下為下調基因。這些都支持了一般而言持久的水分缺乏阻礙細胞生長的觀點。25. 干旱反應基因的順式調節為了鑒定順勢調節因子可能介導已鑒定出來的干旱反應基因的轉錄調節，我們設計了一個轉錄因子探索傳遞途徑：（CRE-discovery pipeline）:利用一個脫-新基序探索工具FIRE來發現新的因子，并把這些發現的因子和權威數據庫已知的順式因子作對比，取出順式調節因子中有意義的序列.分析mDr處理后1天、10天和pDr基因序列（進一步分為上調和下調）的順式因子傳遞途徑，來鑒定幾個已知的和新發現的順式調節因子（CREs）2

17、6. 順式調節因子突顯在mDr處理后第1天和pDr的上調基因中，這和實驗鑒別的ACGT-包含在ABRE-(ABA響應元件)序列ACGTG(G/T)C中高度相似（見圖5）。在pDr-ABRE中位置6(G/T)的簡并性恰好保留下來，而在mDr Day01-ABRE中它是嚴格的T.有趣的是， mDr Day10的下調基因中發現的一個因子和ABRE -A(A/C)(A/C)RCGTG非常相似。27. 在mDr Day01的上調基因和mDr Day10的下調基因中發現另一個支持反向調節的因子和DRE/CRT-序列(A/G)CCGAC高度相似.適度干旱處理后第1天（mDr Day01）中的上調基因中鑒別出

18、的UPRE-類似因子給予了有力的證實。與此相反，一種UPRE-類似因子在pDr的下調基因中被鑒別出來。這里必須指出在mDr Day10和pDr條件下，下調基因中蛋白質折疊非常豐富，這證實了在這兩個處理中蛋白質折疊是受影響的。28. 在mDr Day01上調基因和mDr Day10上調和下調基因中發現了兩個富含AT序列的元件：前者和光反應基因的順式調節因子相似，后者和擬南芥中控制生理節奏的夜晚環境基因表達相似。一種新的順式調節因子（CRE） (G/T)(A/C)CAGCT(A/C/G)(A/T) 在mDr Day10的下調基因中被鑒別出來，它非常豐富但是它的功能我們還不知道。29. 干旱脅迫下細

19、胞的新陳代謝總體的基因表達分析顯示了在pDr-萎焉干旱條件下大量的光合作用基因下調，而在mDr條件下變化很不明顯。在擬南芥中多于50%的光合作用產物以淀粉的形式儲存。因此，我們檢驗兩種干旱處理中關于淀粉的生物合成和降解基因表達的結果。在pDr條件下，淀粉的生物降解中的兩種酶即-淀粉酶、-淀粉酶，分別以log21.5、log23的速率表達。在mDr條件下只有-淀粉酶以log20.4的速率表達。為了證實這些觀察結果，在這兩種干旱處理中對植物樣本進行了量化。在下午的后期采收生長期相同的植物體，即萎焉1天的植物和mDr處理后1天的植物。淀粉分析表明在萎焉的植物中沒有淀粉積累，而mDr處理后1天的植物淀

20、粉累積量和正常植物差不多（具體數據未給出）。30. 對mDr處理以時間程序的氣體交換測量顯示了植物的光合作用速率幾乎接近正常水平（圖4A）。因為擬南芥大于50%的光合作用產物都以淀粉的形式儲存，因此在mDr條件下以時間程序進行的實驗中我們需要通過淀粉的量化來確定氣體的交換量。淀粉的濃度在5個時間點來確定：mDr處理的-1,0,1,2,3天，這些時間點的淀粉濃度和水分充足條件下相應時間點的淀粉濃度沒有顯著地區別（數據未給出）。為了測定mDr條件下滲透壓的適應性，在mDr的第3天和第4天對脯氨酸的含量進行了測定。我們發現干旱處理條件下和水分充足條件下相比沒有顯著地變化。31. 因為脫落酸(ABA)

21、是最重要的壓力激素，我們也在mDr條件下以時間程序進行的實驗中對ABA濃度的變化進行了測定。在mDr處理的當天植物積累了很高濃度的ABA，濃度繼續升高直到mDr處理后1天（見圖8A），在mDr處理后第2天ABA濃度開始下降。32. 干旱脅迫下壓力信號傳送途徑基因的表達 在pDr萎焉前（PPW）條件下和mDr條件下相比，ABA生物合成基因NCED3被多誘導了4倍（見圖8B）pDr條件下與mDr條件下相比，干旱反應轉錄因子DREB2A被誘導至更高的水平。在兩種干旱處理中另一個基因RD29B顯示了差異性表達，它在pDr條件下被誘導了將近100倍，而在mDr處理后第1天它變化了20倍（圖8B）。測定的

22、其它壓力信號傳送基因的干旱反應表達水平在兩種干旱處理條件下沒有顯著的不同（圖8B）。33. 壓力信號傳送途徑（ABA依賴型和非ABA依賴型）中的兩種關鍵基因的表達水平在mDr處理分析中以時間程序被量化。NCED3是ABA生物合成中的一種關鍵酶，它在mDr處理的第0天和第1天與第-1,2,3天相比被高度誘導表達（圖8C）。在mDr處理的當天（0day）ABF3(ABA依賴型途徑中的基因)的表達量很高，之后它的表達量降低。在非ABA依賴型途徑中，DREB2A在第0天開始被誘導表達且持續到處理后第1天，之后它的表達量下降（圖8D）。34. NCED3, ABF3, 和 DREB2A,的下游有很多反應

23、基因，它們都被認為是壓力標記基因：RD22, RD29A, RD29B, and RAB18.。在mDr處理的按時間程序的實驗中，這些標記基因在mDr處理當天（0 Day）被誘導表達并且持續到處理后第1天，之后其表達量降低（圖8E）。35. mDr條件下氣孔反應的時間程序分析為了在分子水平了解氣孔對mDr處理的反應，在我們mDr微序列數據庫中選擇了一系列的氣孔相關的基因，來研究它們在mDr時間進程中的表達動力學。PLD1 和 GPA1,是氣孔中ABA信號傳送的兩個正調節因子，mDr條件下它們的表達量從第-1天開始增加到處理后第1天達到最大值，之后開始下降（見圖9A）。因為在氣孔對周圍環境的反應

24、中外流的鉀離子通道起著很重要的作用，我們對外流的鉀離子通道基因GORK的表達進行了量化，在mDr處理后第1天GORK的誘導表達量最高，從第2天開始下降(圖9A)。36. 在氣孔反應和ABA信號傳送途徑中另一組起主要作用的基因屬于屬于蛋白質磷酸酶家族C型（PP2Cs）。因此我們檢測了三種主要的PP2Cs基因（ABI1, ABI2, and HAB1.）的表達圖譜。在mDr處理的-1天ABI1, ABI2的表達開始上升，一直持續到處理后第1天，然后降低（圖9B）。HAB1.在mDr處理的-1天表達降低，在mDr處理后第1天誘導表達，之后下降（圖9B）。37. 在氣孔中，ABA信號傳送的早期反應中，

25、一個類似受體的激酶1（RPK1）活性很高，它在mDr的微序列中被誘導表達。在mDr條件下，對RPK1進行的時間程序分析顯示，在mDr處理的-1天被誘導表達，它持續到處理后第1天，之后開始下降（圖9C）。38. 在我們的干旱微序列中我們發現MY60在mDr處理后第1天和pDr條件下被抑制。已經發現這個基因在保衛細胞中特異性表達，它的無效突變體抑制氣孔打開。因此我們檢測了mDr條件下按時間程序的反應，在五個時間點對MY60的表達進行了量化。MY60在mDr處理的-1天和0天被誘導表達（圖9D），在處理后第1天被抑制，從處理后第2天開始穩定直到水分充足（圖9D）。39. 干旱脅迫條件下的光合作用和抗

26、氧化基因的表達mDr和pDr微序列比較顯示：很多光合作用基因在萎焉條件下受到顯著地抑制，相反mDr處理條件下其基因表達所受影響不明顯（見附表S1）。我們選擇了幾個光合作用基因，在mDr時間程序實驗中它們的表達圖譜是光系統1（PSI (PQL2, PSAH2) 和光系統II （PSII (PSBW, PSBQA)的 蛋白質（圖10A）。PSBW的表達從mDr處理后第1天開始顯著降低，到mDr處理后第2天到達最低水平。然而PSBQA的表達在mDr處理的-1、0、1天都是正常的，從處理后第2天開始下降。光系統1亞組基因PQL2在mDr處理中的-1、0、1、2天其表達到處于正常水平，從處理后第3天開始

27、下降。PSAH2在-1天被誘導表達，第0天降低至正常水平，在處理后第1天和第2天又被誘導表達，在第3受到抑制（見圖10A）。40. 為了測定氧化壓力相關的對mDr反應的分子活動，選擇了具有抗氧化活性的6種酶：抗壞血酸鹽過氧化物酶1（APX1），硫氧化還原蛋白過氧化物酶1（TPX1），谷胱甘肽過氧化物酶6（GPX6），胞質Cu/Zn岐化酶（CSD1），葉綠體Cu/Zn岐化酶（CSD2）和Fe岐化酶（FSD1）。APX1和TPX1的表達在時間進程中發生微小的變化（圖10B）。GPX6在mDr處理后第1天急劇下降。CSD1和CSD2在mDr處理后第1天和第2天受到顯著的抑制，而FSD1在整個時間進程

28、中變化不顯著（見圖10B）41. 干旱條件下細胞擴張基因的表達 mDr條件下細胞擴張基因的誘導表達是特異的，同樣的基因在pDr條件下被下調或沒有差異性表達。通過mDr和pDr條件下ABA反應基因微序列數據庫的比較，顯示了在mDr條件下比pDr萎焉和ABA處理條件下的細胞擴張基因表達升高。因此，我們對pDr萎焉前（PPW）和mDr(MD)處理對細胞擴張基因表達水平的影響進行了量化，這些基因為：EXPA3, EXPA4, EXPA8, EXPA10, 和EXBL1（圖11A）。mDr處理后1天大部分擴張基因被誘導表達，而在pDr條件下EXPA3和EXPA8被抑制，EXPA4保持不變（圖11A）。42. 在mDr處理的時間進程分析中EXPA3, EXPA4, EXPA8, EXPA10基因在第0天被抑制，在處理后第1天被誘導表達，隨后處理后第2天和第3天表達下降（見圖11B）。EXBL1基因的表達穩定增加直到mDr處理后第1天，然后逐漸下降，直到處理后第3天達到水分充足條件下的正常表達水平。43. 討論干旱條件下生長受阻我們的興趣在于找到干旱條件下植物生長受阻的原因，產生反應的時間，以及在生理、生化、分子水平上導致生