1、本科畢業(yè)論文題目： 高效液相色譜法測定 阿德福韋酯的含量 學(xué)院： 化學(xué)與化工學(xué)院 班級： 09級化學(xué)6班 姓名： 豐志娟 指導(dǎo)教師： 關(guān)翠林 職稱： 副教授 完成日期： 2013 年 5 月 29 日高效液相色譜法測定阿德福韋酯的含量摘要：目的：建立高效液相色譜法測定阿德福韋酯的含量。方法：采用高效液相色譜紫外檢測法測定阿德福韋酯的含量，檢測波長：261nm;色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(5µm,250mm×4.6mm)；流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀-乙腈（用0.1mol/L氫氧化鉀調(diào)pH至6.0）（60:40）；流速：1.0mL/min；柱溫：25；進(jìn)樣量：20

2、uL。結(jié)果：在0.02060.1032mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好（r=0.9997）,平均加樣回收率為99.89%，RSD為0.14%。結(jié)論：此方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，完全適用于阿德福韋酯含量的檢測。關(guān)鍵詞：高效液相色譜；阿德福韋酯；含量測定 目錄1 引言.(1) 1.1 高效液相色譜概要.(1) 1.2 課題背景和意義.(2)2 實驗部分.(3) 2.1 實驗材料.(3) 2.1.1 實驗儀器.(3) 2.1.2 實驗試劑.(4) 2.2 實驗方法.(4) 2.2.1 色譜條件.(4) 2.2.2 供試品溶液的配制.(4) 2.2.3 對照品溶液的配制.(5) 3 結(jié)果與討論.(5)

3、 3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗.(5) 3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性回歸分析.(6) 3.3 精密度試驗.(7)3.3.1 重復(fù)性試驗.(7) 3.3.2 中間精密度試驗.(7) 3.4 溶液穩(wěn)定性試驗.(8) 3.5 回收試驗.(8) 3.6 含量測定.(9)4 結(jié)論.(11)參考文獻(xiàn)：.(12)ABSTRACT：.(13)致謝：.(14)1 引言1.1 高效液相色譜概要高效液相色譜法是一種高效、快速及應(yīng)用廣泛的現(xiàn)代分離技術(shù)，具有分離效率高，選擇性好、分析速度快、操作自動化、應(yīng)用范圍廣的特點，已經(jīng)成為有機(jī)物質(zhì)分析的支柱技術(shù)，在生物化學(xué)、食品檢驗、臨床醫(yī)學(xué)、石油化工及環(huán)境污染監(jiān)測等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用

4、1。其原理是根據(jù)混合物中各組分在固定相和流動相中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相做相對移動時，各組分在兩項中進(jìn)行反復(fù)多次分配，產(chǎn)生明顯的分離效果，從而依次洗出色譜柱2。根據(jù)流動相的狀態(tài)可分為氣相色譜法和液相色譜法。 1903年，俄國植物學(xué)家發(fā)表了題為“一種新型吸附現(xiàn)象及在生化分析上的應(yīng)用”的研究論文，文中第一次提出了應(yīng)用吸附原理分離植物色素的新方法。1906年，他命名這種方法為色譜法。這種簡易的分離技術(shù)，奠定了傳統(tǒng)色譜法基礎(chǔ)3。高效液相色譜法是20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入氣相色譜理論，在技術(shù)上采用高壓輸液泵，梯度洗脫技術(shù)，新型高效填充劑以及各種高靈

5、敏度檢測器，與經(jīng)典液相色譜法相比較，具有分析速度快，分離效率高，靈敏度高和操作自動化等優(yōu)點。它是吸納了經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的優(yōu)點進(jìn)行改進(jìn)和發(fā)展起來的的現(xiàn)代分析方法4。由于使用高壓泵輸送流動相，采用梯度洗脫裝置，可在柱后直接檢測流出液成分，高效液相色譜法完成分離的時間只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典色譜法快數(shù)百倍。而且與氣相色譜法相比，只要求試劑能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試劑揮發(fā)性的限制，對于高沸點、熱不穩(wěn)定性差、相對分子質(zhì)量大的有機(jī)物，原則上都可用高效液相色譜法來進(jìn)行分離，分析5。 化學(xué)藥物是防病治病的重要藥物，藥物質(zhì)量一直是非常重要的問題6。高效液相色譜法問世不久就被應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域

6、的某些研究工作，隨著檢測器和衍生化技術(shù)的發(fā)展以及樣品預(yù)處理技術(shù)的改進(jìn)，分析的靈敏度也明顯提高7。HTLP法應(yīng)用于藥物分析的數(shù)十年來，越來越成為藥物分析的重要方法。近年來，隨著HTLP法在藥物領(lǐng)域中的發(fā)展應(yīng)用，HTLP法已經(jīng)成為藥物分析測定的主要手段。液相色譜檢測器（紫外檢測器，熒光檢測器，電化學(xué)檢測器)的多樣性發(fā)展使得液相色譜的應(yīng)用范圍得到進(jìn)一步拓寬。1.2 課題背景和意義 本品的中文名：阿德福韋酯，系根據(jù)國家藥典委員會編訂的中國藥品通用名稱將“Adefovir”譯為“阿德福韋”。其英文名為Adefovir Dipivoxil，是阿德福韋的雙新戊酰氧基甲酯化物，故簡稱為“阿德福韋酯”。分子式：

7、C20H32N5O8P，化學(xué)名：9-2-雙（新戊酰氧基甲氧基）磷酰甲氧基乙基腺嘌呤，本品外觀性狀為白色或類白色粉末，味微苦，熔點為:97103。 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病8。據(jù)統(tǒng)計，世界上大約有3.5億慢性HBV攜帶者，每年大約有100萬人死于HBV引起的疾病，世界衛(wèi)生組織已把乙型肝炎列為世界第九死因。在我國約有1.2億人是乙肝病毒攜帶者，現(xiàn)患乙肝者2800萬，患病率為2770/10萬，且三分之一的人會演變成慢性肝炎、肝硬化或肝癌。已確認(rèn)的6種肝炎病毒中，乙型和丙型肝炎危害性最大，易轉(zhuǎn)化為慢性肝炎，也是肝硬化和原發(fā)性

8、肝癌的直接誘因。1998年全世界有200萬人死于這兩種肝炎病毒引起的肝癌，中國也有30萬人死亡。一旦感染上肝炎，就必須長期不間斷服藥，我國每年對癥治療各種病毒性肝炎所需醫(yī)療費用約300500億元人民幣。高額的用藥費用給國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展帶來了巨大壓力,如何預(yù)防和治療肝炎成為當(dāng)今重要的醫(yī)學(xué)課題。 目前我國使用較多的肝炎用藥(化學(xué)藥物)，大多為工藝改進(jìn)的藥物或進(jìn)口藥物，治療肝炎的效果或不甚理想，或價格偏高，加劇了患者的用藥負(fù)擔(dān)。 核苷類藥物是近年來抗HBV藥物研究的熱點，進(jìn)展很快。阿德福韋酯(adefovir dipivoxil)是一種核苷類廣譜抗病毒藥物9，是無環(huán)腺嘌呤單核苷酸衍生物阿德福韋(a

9、defovir)的前藥，它不穩(wěn)定，易發(fā)生水解產(chǎn)生阿德福韋單酯和9-（2-膦酰甲氧乙基）腺嘌呤（PMEA)10。口服吸收后，迅速被非特異性酶水解形成阿德福韋，再經(jīng)兩步磷酸酯化形成阿德福韋酯，后者可以與腺苷酸競爭性滲入病毒DNA鏈，作為終止物抑制DNA聚合酶，終止DNA新生鏈的合成,抑制病毒的復(fù)制，從而發(fā)揮抗病毒作用。11阿德福韋在體外具有抗肝DNA病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和皰疹病毒的廣譜抗病毒活性。它在細(xì)胞內(nèi)的活性代謝物為阿德福韋雙磷酸酯，后者選擇性抑制HBV DNA聚合酶。由于阿德福韋的磷酸酯基帶負(fù)電荷，阿德福韋口服后在腸內(nèi)吸收不佳，因此開發(fā)了前藥阿德福韋酯，以提高生物利用度。口服后前藥部分迅速被酯酶

10、水解釋放出游離的阿德福韋進(jìn)入門靜脈和全身循環(huán)。本藥的研制開發(fā)可能為防治乙肝提供有力的武器。 阿德福韋酯（adefovir dipivoxil）由美國Gilead Sciences公司開發(fā)，于2002年9月20日被FDA批準(zhǔn)用于治療成人慢性乙肝（HBV），2005年被中國慢性乙型肝炎防治指南推薦為一線抗病毒藥物12，是第二個被FDA批準(zhǔn)上市的抗HBV藥物。劑型為口服片劑，規(guī)格10mg，商品名為Hepsera。適應(yīng)癥包括代償性慢性乙肝，HBeAg陽性和陰性的患者，對拉米夫定耐藥的慢性乙肝（包括代償或失償肝病的患者），肝移植手術(shù)前后和合并HIV感染的慢性乙肝患者13。迄今為止的臨床實驗中，患者對阿德

11、福韋酯的耐受性較好。其長期使用療效穩(wěn)定、病毒變異率低，在一定程度上減小了第一代核苷類藥物誘發(fā)的病毒變異給醫(yī)生帶來的困擾14。與目前治療乙型肝炎的藥物干擾素和拉米夫定相比，其在療效、不良反應(yīng)和傳遞方式等方面均有明顯優(yōu)勢15，是目前比較理想的抗乙肝病毒的藥物。2 實驗部分2.1 實驗材料2.1.1 實驗儀器 LC-100高效液相色譜儀：配LC-UV100紫外檢測器，LC-P100高壓恒流泵， LC-CO100柱恒溫箱(上海伍豐儀器有限公司) 色譜工作站：LC-UV100 伍豐液相色譜工作站 溶劑微孔過濾膜（直徑50mm,孔徑0.45µm，美國津騰PALL原產(chǎn)膜） SHB-IIIA循環(huán)水式

12、多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司） KQ-50B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司) HANGPINGFA2004電子天平(上海天平儀器廠) 吸量管（5ml,25) 容量瓶（100ml,50ml,25)2.1.2 實驗試劑 乙腈(C2H3N,acetonitrile,色譜純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司) 磷酸二氫鉀（KH2PO4,potassium dihydrogen phosphate ,分析純AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司） 氫氧化鈉（NaOH,Sodium hydroxide ,分析純AR，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司） 阿德福韋酯原料（C20H32N5O8P，Adefovi

13、r Dipivoxil，由海南國棟藥物研究所提供,批號：20020601、20020602、20020603） 阿德福韋酯對照品（由海南國棟藥物研究所提供，批號GD-2006，含量99.4%） 純化水2.2 實驗方法2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠柱(5µm,250mm×4.6mm) 流動相：0.02mol/L磷酸二氫鉀：乙腈（用0.1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH至6.0）（60:40）檢測波長：261nm流速：1.0mL/min進(jìn)樣量：20uL柱溫：252.2.2 供試品溶液的配制 取阿德福韋酯原料32mg，精密稱定,置于50mL容量瓶中，加流動相適量振搖使

14、之溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml置于另一50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度,搖勻。2.2.3 對照品溶液的配制另取阿德福韋酯對照品約32mg，精密稱定,置于50mL容量瓶中，加流動相適量振搖使之溶解后，加流動相稀釋至刻度，搖勻；精密量取5ml置于另一50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度,搖勻。3 結(jié)果與討論3.1 系統(tǒng)適用性試驗分別取對照品溶液和供試品溶液各20l注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果見圖1、圖2。 圖1 對照溶液色譜圖 Fig.1 Chromatogram of reference substance 圖2 樣品溶液色譜圖 Fig.2 Chromatogram

15、of sample從上圖測定結(jié)果可知，在項色譜條件下，理論板數(shù)n2000；分離度R1.5。3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性回歸分析 取阿德福韋酯對照品約51.6mg，精密稱定，置于100ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋成每1mL中含阿德福韋酯0.516mg的溶液，搖勻，用吸量管移取該溶液1、2、3、4、5mL于5個25mL容量瓶中，加流動相定容,取各溶液連續(xù)進(jìn)樣，測量結(jié)果見表1。表 1 線性關(guān)系試驗結(jié)果 Table 1 Test results of linear determination溶液濃度（mg/mL）主峰面積0.02066187740.041313154890.061919335430

16、.085626329500.10323236121以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。 圖3 線性回歸分析圖 Fig.3 Linear regression analysis 經(jīng)線性回歸分析，在0.02060.1032mg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。3.3 精密度試驗3.3.1 重復(fù)性試驗取阿德福韋酯原料，加流動相制成濃度約為65ug/mL的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果如下： 表2 重復(fù)性試驗結(jié)果 Table 2 Test results of repeatability次數(shù)123456主峰面積194911019596091978056195755619598521969403平均峰面積1962

17、264SD10084RSD0.51% 試驗結(jié)果表明，進(jìn)樣重復(fù)性能滿足本品的含量測定要求。3.3.2 中間精密度試驗由不同的人于不同的時間在兩臺儀器上，取項下的溶液，經(jīng)多次取樣，分別對本品進(jìn)行含量測定，結(jié)果見下表。表3 中間精密度試驗測定結(jié)果 Table 3 Test results of intermediate precision 含量(%)操作者A操作者B第1天第2天第1天第2天第一臺99.198.899.299.298.991.299.099.299.299.199.298.899.198.999.199.299.199.299.298.8第二臺98.999.099.299.199.19

18、9.199.199.199.199.298.898.998.899.199.299.199.099.299.099.2平均含量(%)98.9RSD(%)1.26 試驗結(jié)果表明，中間精密度試驗相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于2.0%。3.4 溶液穩(wěn)定性試驗取項下的溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8小時取樣分析，結(jié)果如下： 表 4 穩(wěn)定性試驗結(jié)果 Table 4 Test results of stabilization時間(h)02468峰面積21076922097761211427020790082093279平均峰面積2098402SD13610RSD0.65%試驗結(jié)果表明，在一個工作日內(nèi)，室溫條件

19、下供試品溶液穩(wěn)定。3.5 回收試驗 精密稱取阿德福韋酯原料25.6mg、32mg、38.4mg，分別置于100mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，每個濃度配制3份。取上述溶液及阿德福韋酯對照品溶液各20L，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測定其峰面積，按外標(biāo)法求得阿德福韋酯的含量，再根據(jù)樣品的投入量計算其回收率，結(jié)果見表5。 表5 加樣回收率實驗結(jié)果 Table 5 Test results of sample recovery rate加入量（百分比）稱量值（mg）測量值（mg）回收率（%）回收率平均（%）RSD（%）80%25.6425.6299.9299.890.14

20、 25.725.6199.6525.7625.7499.92100%32.13299.6932.1232.199.9432.0532.07100.06120%38.4138.42100.0338.4538.4299.9238.538.4699.903.6 含量測定 取本品三批，按上述方法對本品含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如下： 表6 含量測定結(jié)果 Table 6 Test results of content批 號含量(%)2002060199.12002060299.02002060399.2 對照品及樣品溶液色譜圖如圖4-7。 圖4 對照溶液色譜圖 Fig.4 Chromatogram of ref

21、erence substance 圖5 20020601 樣品溶液色譜圖 Fig.5 Chromatogram of sample 20020601 圖6 20020602樣品溶液色譜圖 Fig.6 Chromatogram of sample 20020602 圖7 20020603樣品溶液色譜圖 Fig.7 Chromatogram of sample 20020603 4 結(jié)論 本實驗采用已確定的HTLP條件測定阿德福韋酯的含量，并對該品線性、準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、最低檢出限進(jìn)行研究。在該HTLP條件下，所測結(jié)果令人滿意。此方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，完全適用于阿德福韋酯含量的檢測。參考文獻(xiàn)：

22、 1 陳福南，高效液相色譜-化學(xué)發(fā)光分析研究D.重慶：西南大學(xué)，2008.2 華中師范大學(xué)，陜西師范大學(xué)，東北師范大學(xué)，等.分析化學(xué)（下冊）M.第三版.北京：高等教育出版社，2001:239.3 王昕.高效液相色譜研究進(jìn)展J.光明中醫(yī)，2011,26（1）：56-58.4 賀家亮，李開雄，劉海燕.高效液相色譜法在食品分析中的應(yīng)用J.品研究與開發(fā)，2008,29（11）：175-177.5 康自華，陽小成，陳婷.高效液相色譜法在藥物分析中的應(yīng)用J.廣東微量元素開發(fā)，2006,13（8）：18-22.6 肖戎.HPLC法測定阿德福韋酯及其相關(guān)雜質(zhì)D.重慶：重慶大學(xué)，2008.7 劉華，趙瓊?cè)?高效

23、液相色譜法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用J.色譜，1986,4（3）：142-145.8 Tedesco K L,Rybak M J.DaptomycinJ.Pharmacotherapy,2004,24(1):41-57.9 蔣曄，徐智儒，張曉青.反相高效液相色譜法測定阿德福韋酯及其降解產(chǎn)物J.色譜，2004,3（22）：248-251.10 何曉艷，盧凱旋，曾伶俐，等.HPLC法測定阿德福韋酯口腔崩解片中阿德福韋酯降解產(chǎn)物的含量J.中國藥師，2012,15(11):1568-1570.11 周采菊，栗瑩，黃華瑞.反相高效液相色譜法測定阿德福韋酯的含量及其有關(guān)物質(zhì)J.藥物分析雜志,2008,28(3):

24、424-426.12 王永英，徐學(xué)君.阿德福韋酯治療肝臟疾病的臨床研究近況J.安徽醫(yī)藥，2012,16（2）：254-255.13 Michael Swartz, Michael Jones /patricia Fowler.Automated HPLC Methtod Development and TransferJ.The Application Notebook,2002(6):49-50.14 王超，王長斌，袁玉.HPLC和UV法測定阿德福韋酯片的含量比較J.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2009,24（25）：3687-3689.15 楊紅，張小念，許滄.反相高效液相色譜法測定阿德福韋酯的含量及其有關(guān)物質(zhì)J.中國抗生素雜志，2005,30(8):477-508.HTLP Determination of Adefovir Dipivoxil ContentAbstract：Objevtive:To establish an method for determining Adefovir Dipivoxil by HTLP.Methods: An high performance liquid chromatography with UV detection was adopted,the detection wav