1、純化前準備1 .推薦在中性至弱堿性條件下（pH7-8）結合重組蛋白。磷酸鹽 buffer 是常用的緩沖液，Tric-Cl 在一般情況下可用，但要注意它會降低結合強度。2 .避免在 buffer 中包含 EDTA 或檸檬酸鹽等螯合劑。3 .若重組蛋白以包涵體形式表達，在所有的 buffer 中添加 6M 鹽酸月瓜或 8M 尿素4 .避免緩沖液中有高濃度的電子供體基團，比如：NH4,甘氨酸，精氨酸，Tris,等等5 .各種緩沖液里不能有高濃度的強還原劑，比如 DTT,防止二價 Ni 被還原；6 .不能含離子型的去垢劑，比如 SDS,防止 Ni 流失；7 .緩沖液里可以加入甘油，防止蛋白之間由于疏水

2、相互作用而發生聚集沉淀，甘油濃度最高可達50%（v/v）8 .緩沖液里 NaCl 的濃度應在 300mM 至 ij2M 之間；9 .可加入非離子型去垢劑，如 Triton,Tween,NP40 等，最高 2%,可以減少背景蛋白污染和去除核酸污染注：1 .包含尿素的樣品可直接進行 SDS-PAGE 分析，若樣品中包含鹽酸月瓜，在 SDS-PAGEB 則需先用含有尿素的 buffer 進行透析2 .除利用咪唾洗脫蛋白，其它方法，如低 pH 值法等可被應用，詳見說明書Bindingbuffer 中咪口坐的濃度在洗滌時所用的 Bindingbuffer 中咪睫濃度越大，重組蛋白純度越高。但過高的咪唾濃

3、度將導致蛋白的洗脫。合適的咪唾濃度需要優化。Buffer 的準備所用的水及化學物質須是高純度的。Buffer 在使用前需經 0.45m 濾膜過濾。所用高純度的咪唾需在 280nm 處無吸光度或吸光度極低。推薦 buffer（使用前用 0.45 仙 mfilter 濾）1 .樣品準備樣品需被充分溶解。過柱前經 0.45（im 濾膜過濾。樣品以 pH7.4bindingbuffer 溶解。勿用強酸強堿調節 pH 值，否則將可能導致沉淀。2 .重力純化法 Ni-NTAColumn 準備1 .溫和地顛倒瓶中的 Ni-NTAAgarose 數次。Bindingbuffer:20mM 磷酸鹽0.5MNaC

4、l20-40mM 咪唾Elutionbuffer:20mM 磷酸鹽0.5MNaCl500mM 咪唾pH7.4pH7.4（咪哇濃度是蛋白依賴的，可變！）（咪哇濃度是蛋白依賴的，可變！）2 .吸取 2ml 的樹脂加入 15ml 離心管中，使樹脂在重力(5-10minutes)或低速離心(5minuteat500 xg),輕柔的吸出上清。3 .加入 5ml 的無菌蒸儲水，溫和的顛倒柱子 3min,離心 5minuteat500 xg,輕柔的吸出上清。4 .用 bingdingbuffer 重復第 3 步。5 .在 Ni 柱中加入等體積的 bingdingbuffer,制成 50%白向 slurryN

5、i 柱子的 beads 浸泡在 20%ethanol 中，傾除 20%ethanol 溶液，用蒸儲水將 beats 調成 75%(v/v)的濃漿狀的凝膠。.沿玻璃棒一次倒入柱子中，靜置。6 .樣品與 Ni 柱結合1 .每 1ml50%的 slurry 中加入 4ml 的樣品。1ml50%的 slurry 可結合 20mgHis-蛋白2 .將混合物室溫，低速振蕩孵育 1h4.Buffer 洗滌及洗脫1 .離心 5minuteat500 xg,輕柔的吸出上清。上清保存放在 4CforSDS-PAGEanalysis2 .用 1mlBindingBuffer 洗滌柱子，在搖床上溫和的振蕩 2min,

6、然后低速離心 5minuteat500 xg,小心吸出上清，重復該步一次。上清保存放在 4CforSDS-PAGEanalysis。3 .用 0.5ml 日 utionbuffer 洗脫柱子，方法同 4。重復該步三次。分管收集 4 次洗脫液，存放在4CforSDS-PAGEanalysis。純化柱的再生：如果純化同一種蛋白，Ni-NTAresin 不需要再生，可以重復使用 57 次。1 .用 5 倍柱體積的含 50mMEDTA,20mM 磷酸鹽，0.5MNaClpH7.4 的 buffer 洗滌柱子，洗去螯合的鍥離子。2 .用 5 倍柱體積的 bindingbuffer 洗滌柱子3 .用 5

7、倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子4 .用 0.5 倍柱體積的含 0.1M 的 NiSO4 的無菌水溶液裝填5 .用 5 倍柱體積的無菌去離子水洗滌柱子6 .用 5 倍柱體積的 bingdingbuffer 洗滌柱子7 .加入 20%的乙醇 4-30C 長期保存。lysisbuffer 中加咪唾的目的是與雜蛋白競爭，使那些與填料親和力弱的雜蛋白不能掛柱；washbuffer 中加咪口坐是為了洗去大部分已掛柱的雜蛋白(也會洗去少量目的蛋白)；elutionbuffer 中加梯度咪陛，而且咪唾濃度漸高，是咪陛和目的蛋白競爭性結合填料，從而把目的蛋白從柱上洗脫。層析柱再生1.除鍥10 倍柱床體積的 st

8、rippingbuffer 洗柱，1ml/min10 倍柱床體積的 bindingbuffer 洗柱，1ml/min(可省)10 倍柱床體積的 ddH2O 洗柱，1ml/min2.除去柱上殘余蛋白1MNaOH 充滿柱并保持 2h10 倍柱床體積的 bindingbuffer 洗柱，1ml/min（可省）10 倍柱床體積的 ddH2O 洗柱，1ml/min3.掛鍥0.5 倍柱床體積的 0.1NiSO4 洗柱，1ml/min5 倍柱床體積的 bindingbuffer 洗柱，1ml/min4.20%乙醇過柱，4c 保存5 倍柱床體積的 ddH2O 洗柱，1ml/min注：strippingbuffer：2mM0.5M50mMNa3PO4NaClNa2EDTApH7.4蛋白純化Elutionbuffer 洗柱10 倍柱床體積的 bindingbuffer 平衡10 倍柱床體積的 bindingbuffer 洗柱超濾管 10000rpm,濃縮離心 10min樣品過濾，上樣（關閥門，15min）Hutionbuffer 洗脫蛋白（一般蛋白位于前 5ml）注:Bindingbuffer：20mMNa3PO40.5MNaCl5mM 咪唾500ml20X10-3X0.5X380.16=3.8g0.5X0.5X58.5=14.625g5義10-3X0.5X68.09=0.17gpH7.4El