1、PC 限術的過程和意義一、PCRfc 術的基本原理類似于 DNA 勺天然復制過程， 其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核昔酸引物。PCR1 一種體外 DNA 擴增技術， 是在模板 DNA 引物和 4 種脫氧核甘酸存在的條件下，依賴于 DNAK 合酶的酶促合反應，將待擴增的 DNAt 段與其兩側互補的寡核甘酸鏈引物經“高溫變性一一低溫退火一一引物延伸”三步反應的多次循環，使 DNAt 段在數量上呈指數增加，從而在短時間內獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環境檢測中， 靶核酸序列往往存在于一個復雜的混合物如細胞提取液中， 且含量很低，對于探測這種復雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感

2、。使用 PC 曲術可將靶序列放大幾個數量級，再用探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結構。二、PC 淑術的步驟PCFtt 變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：1、模板 DNA 勺變性模板 DNAS 加熱至 93c 左右一定時間后，使模板 DNAK 鏈或經 PCFT 增形成的雙鏈 DNA 單離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；2、模板 DNAf引物的退火（復性）模板 DNAS 加熱變性成單鏈后，溫度降至 55c 左右，引物與模板 DNAI 鏈的互補序列配對結合；3、引物的延伸DNA 真板-引物結合物在 TaqDNAS 合酶的作用下，以 dNTF%反應原料，靶

3、序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 24分鐘，23 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期（Plateau）所需循環次數取決于樣品中模板的拷貝。三、PCRfc 術的意義1、特異性強PCRE 應的特異性決定因素為：引物與模板 DNAI 異正確的結合；堿基配對原則；TaqDNA 聚合酶合成反應的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結合是關鍵。 引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶

4、合成反應的忠實性及 TaqDN 臊合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合（復性）可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR 產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克（pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（g=-6）水平。能從 100 萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中， PCR 勺靈敏度可達 3 個 RFU 空斑形成單位）； 在細菌學中最小檢出率為 3 個細菌。3、簡便、快速PCRK 應用耐高溫的 TaqDNA 聚合酶，一次性地將反應液加好后，即在 DNA

5、擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在 24 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。4、對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗制品及 RNA 勻可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等 DNAT 增檢測。四、PCRK 術主要應用的領域1、核酸的基礎研究：基因組克隆2、不對稱 PCFJ 備單鏈 DNAffl 于 DNAW 序3、反向 PCRM 定未知 DNAZ：域4、反轉錄 PCR（RT-PCR 用于檢測細胞中基因表達水平、RNAW 毒量以及直接克隆特定基因的 cDNA5、熒光定量 P

6、CRffl 于對 PCR物實時監控6、cDNAHC 端快速擴增技術7、檢測基因的表達8、醫學應用：檢測細菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾病；診斷月中瘤；應用于法醫物證學。五、關于 RT-PCR4 月 17 日，在北京檢驗檢疫局承擔的國家質檢總局科技計劃項目“禽流感病毒H7N9 亞型雙重熒光 RT-PCRS 型技術研究”鑒定會上，專家組一致認為：該項目創新性地實現了對禽流感病毒 H7N9 亞型的一步快速定型， 可在一次檢測中確認樣品中是否存在 H7N9亞型禽流感病毒或其他 H7亞型和 N9亞型的禽流感病毒;在通用性、 特異性、靈敏性上，技術優勢突出。專家組同意項目成果通過鑒定，并建議在進一步擴大和完善動物臨床驗證實驗基礎上，盡快推廣應用。RT-PCR為反轉錄 RCRreversetranscriptionPCR和實時 PCRrealtimePCR共同的縮寫。逆轉錄 PCR 或者稱反轉錄 PCR(reversetranscription-PCR,RT-PCR)是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。 在 RT-PCR,一條 RNAg 被逆轉錄成為互補 DNA再以此為模板通過 PCRTDNAT 增。RT-PCRg 術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中 RNAW 毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNAff 列。作為模板的 RN