1、第六章抗體工程制藥第六章抗體工程制藥藥學(xué)院藥劑教研室藥學(xué)院藥劑教研室 高秀蓉高秀蓉第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述一、基本概念一、基本概念1、抗體（、抗體（antibody，Ab）l指機(jī)體的免疫細(xì)胞被指機(jī)體的免疫細(xì)胞被抗原抗原激活后，由激活后，由B淋巴細(xì)胞增殖淋巴細(xì)胞增殖分化成的分化成的漿細(xì)胞漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性特異性結(jié)合的免疫球蛋白。結(jié)合的免疫球蛋白。l主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中。 即能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的即能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白。球蛋白。2、免疫球蛋白（

2、、免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig ）l具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)上與抗體相似的球蛋白。白。l因結(jié)構(gòu)不同可分為因結(jié)構(gòu)不同可分為IgG、IgA、IgM、IgD和和IgE 5種種。 免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念。免疫球蛋白是結(jié)構(gòu)及化學(xué)的概念，而抗體是生物學(xué)及功能的概念。 3、抗原（、抗原（antigen，Ag）l一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異性免疫一類能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)使之產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物應(yīng)答，并能與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體抗體)在體內(nèi)在體內(nèi)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)外發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)。l抗原

3、的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，抗原的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是也就是免疫原性免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是也就是反應(yīng)原性反應(yīng)原性。 抗原的分類抗原的分類 n完全抗原（完全抗原（complete antigen） 簡(jiǎn)稱抗原。是一類既有免疫原性，又有簡(jiǎn)稱抗原。是一類既有免疫原性，又有反應(yīng)性反應(yīng)性性性的物質(zhì)。如大多數(shù)的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)、細(xì)菌、病毒、細(xì)菌、病毒、細(xì)細(xì)菌外毒素菌外毒素等都是完全抗原。等都是完全抗原。n不完全抗原不完全抗原 即半抗原，是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原即半抗原，是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原

4、性的物質(zhì)。如：多糖、青霉素、磺胺劑和花粉性的物質(zhì)。如：多糖、青霉素、磺胺劑和花粉等。半抗原與蛋白質(zhì)等。半抗原與蛋白質(zhì)載體載體結(jié)合后，就獲得了免結(jié)合后，就獲得了免疫原性。疫原性。 4、抗原表位（、抗原表位（epitope）l指抗原分子中決定抗原特異性的特殊指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)化學(xué)基團(tuán)。 l 又稱為又稱為抗原決定簇抗原決定簇。抗體工程制藥抗體工程制藥（antibody engineering pharmaceutics）l是指利用基因工程、細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物是指利用基因工程、細(xì)胞工程和轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物技術(shù)技術(shù)生產(chǎn)抗體藥物生產(chǎn)抗體藥物的過程。的過程。抗體藥物的應(yīng)用抗體藥物的應(yīng)用

5、n治療腫瘤治療腫瘤 目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在目前在臨床中使用的腫瘤治療藥物多數(shù)存在“敵敵我不分我不分”的問題，即在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞的問題，即在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也破壞了人體正常細(xì)胞。了人體正常細(xì)胞。 “生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)理想的為解決這個(gè)難題提供了一個(gè)理想的思路。思路。“生物導(dǎo)彈生物導(dǎo)彈”，即將各種毒素、放射性同位素、，即將各種毒素、放射性同位素、化療藥物與識(shí)別腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原的抗體化療藥物與識(shí)別腫瘤特異抗原或腫瘤相關(guān)抗原的抗體偶聯(lián)后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類藥物。這種藥偶聯(lián)后，能夠特異殺傷腫瘤細(xì)胞的一類藥物。這種藥物經(jīng)由靜脈注入人體

6、內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)物經(jīng)由靜脈注入人體內(nèi)，藥效分子集中作用于腫瘤細(xì)胞，既增強(qiáng)療效又減少對(duì)機(jī)體的毒副作用。放射性同胞，既增強(qiáng)療效又減少對(duì)機(jī)體的毒副作用。放射性同位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，位素與抗體的偶聯(lián)物在體內(nèi)能將前者運(yùn)至藥靶部位，并通過其放射性活性殺傷靶細(xì)胞。并通過其放射性活性殺傷靶細(xì)胞。n逆轉(zhuǎn)器官移植排斥逆轉(zhuǎn)器官移植排斥 進(jìn)行器官移植時(shí)，可以采用某些抗體類藥物來進(jìn)行器官移植時(shí)，可以采用某些抗體類藥物來逆轉(zhuǎn)器官移植引起的排斥反應(yīng)。如最早批準(zhǔn)逆轉(zhuǎn)器官移植引起的排斥反應(yīng)。如最早批準(zhǔn)（1986年）進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)的治療性抗體類藥年）進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)的治療性抗體類藥物物抗抗CD3單

7、抗即被用于腎、心臟、肝臟移單抗即被用于腎、心臟、肝臟移植排斥的逆轉(zhuǎn)。植排斥的逆轉(zhuǎn)。 n目前正在進(jìn)行開發(fā)和已經(jīng)投入市場(chǎng)的抗體藥物主要有目前正在進(jìn)行開發(fā)和已經(jīng)投入市場(chǎng)的抗體藥物主要有以下幾種用途：以下幾種用途： 1器官移植排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)；器官移植排斥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)； 2腫瘤免疫診斷；腫瘤免疫診斷； 3腫瘤免疫顯像；腫瘤免疫顯像； 4腫瘤導(dǎo)向治療；腫瘤導(dǎo)向治療； 5哮喘、牛皮癬、類哮喘、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡紅斑狼瘡、急、急性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他性心梗、膿毒癥、多發(fā)性硬化癥及其他自身免疫自身免疫性疾性疾病；病； 6抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤苗治療腫瘤；抗獨(dú)特型抗體作為分子瘤

8、苗治療腫瘤； 抗體工程的發(fā)展抗體工程的發(fā)展19371937年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球年用電泳法將血清分為白蛋白、甲種、乙種、丙種球蛋白，并證明抗體活性主要存在于蛋白，并證明抗體活性主要存在于丙種球蛋白丙種球蛋白組分。組分。1975年，年，kohler和和milstein首次利用首次利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備出術(shù)制備出 單克隆抗體單克隆抗體，得以規(guī)模化制備特異性、均質(zhì)性，得以規(guī)模化制備特異性、均質(zhì)性抗體。抗體。通過通過基因工程技術(shù)基因工程技術(shù)制備人制備人- -鼠嵌合抗體、人源化抗體等。鼠嵌合抗體、人源化抗體等。抗體技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷的三個(gè)階段：抗體技術(shù)發(fā)展經(jīng)歷的三

9、個(gè)階段：l第一代：抗血清多克隆抗體第一代：抗血清多克隆抗體l第二代：第二代：70年代中期，利用年代中期，利用B淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)制備的雜交瘤單克隆抗體（備的雜交瘤單克隆抗體（McAb）l第三代：基因工程抗體。第三代：基因工程抗體。多克隆抗體多克隆抗體(polyclonal antibody,pAb)n天然抗原分子中常含天然抗原分子中常含有有多種抗原決定簇多種抗原決定簇，以該物質(zhì)刺激機(jī)體，以該物質(zhì)刺激機(jī)體，體內(nèi)體內(nèi)多個(gè)多個(gè)B淋巴細(xì)胞被淋巴細(xì)胞被激活激活，產(chǎn)生的抗體實(shí)，產(chǎn)生的抗體實(shí)際上含有針對(duì)多種不際上含有針對(duì)多種不同抗原表位的抗體，同抗原表位的抗體，是多克隆抗體；是多克隆抗體

10、； 1、抗血清、抗血清l動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的動(dòng)物脾臟有上百萬種不同的B淋巴細(xì)胞系淋巴細(xì)胞系，不同的，不同的B淋巴細(xì)淋巴細(xì)胞合成不同的抗體。胞合成不同的抗體。多克隆抗體的產(chǎn)生過程多克隆抗體的產(chǎn)生過程l當(dāng)機(jī)體受當(dāng)機(jī)體受抗原抗原刺激時(shí)，抗原刺激時(shí)，抗原分子上的許多決定簇分別分子上的許多決定簇分別激激活各個(gè)活各個(gè)B細(xì)胞細(xì)胞。l被激活的被激活的B細(xì)胞分裂細(xì)胞分裂增殖形成增殖形成漿細(xì)胞漿細(xì)胞，大量的漿細(xì)胞合成，大量的漿細(xì)胞合成和分泌大量的抗體分子分布和分泌大量的抗體分子分布到血液、體液中。到血液、體液中。獲得多抗的途徑：獲得多抗的途徑：n動(dòng)物免疫血清動(dòng)物免疫血清n恢復(fù)期患者血清恢復(fù)期患者血清n免疫接種

11、人群血清免疫接種人群血清動(dòng)物抗血清的優(yōu)缺點(diǎn)動(dòng)物抗血清的優(yōu)缺點(diǎn)n從動(dòng)物血清提取抗體主要克服了人血漿來源有從動(dòng)物血清提取抗體主要克服了人血漿來源有限造成的制約。限造成的制約。n然而，動(dòng)物來源產(chǎn)品均存在潛在的危險(xiǎn)，如然而，動(dòng)物來源產(chǎn)品均存在潛在的危險(xiǎn)，如過過敏敏和和傳播感染性病原體傳播感染性病原體等。等。n多抗多抗體異性不高體異性不高，易發(fā)生交叉反應(yīng)。，易發(fā)生交叉反應(yīng)。 解決單抗特異性不高的理想方法是針對(duì)單一解決單抗特異性不高的理想方法是針對(duì)單一表位的特異性抗體表位的特異性抗體-單克隆抗體單克隆抗體。2、單克隆抗體（、單克隆抗體（monoclonal antibody， mAb ） n如果能選出一個(gè)

12、漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞如果能選出一個(gè)漿細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，就可得到由單細(xì)胞經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即經(jīng)分裂增殖而形成細(xì)胞群，即單克隆單克隆。單克隆細(xì)胞將。單克隆細(xì)胞將合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為合成針對(duì)一種抗原決定簇的抗體，稱為單克隆抗體單克隆抗體（mAb）。單克隆抗體的概念單克隆抗體的概念問題：n漿細(xì)胞在體外壽命短，難以培養(yǎng)和擴(kuò)增，怎么漿細(xì)胞在體外壽命短，難以培養(yǎng)和擴(kuò)增，怎么辦？辦？解決辦法解決辦法 1975年，年，kohler和和milstein將以下兩種細(xì)胞將以下兩種細(xì)胞融合：融合：lB細(xì)胞細(xì)胞：能產(chǎn)生抗體，但壽命短：能產(chǎn)生抗體，但壽命短l骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)骨髓瘤細(xì)胞：壽命長(zhǎng)雜

13、交瘤細(xì)胞雜交瘤細(xì)胞mAb制備過程制備過程l每個(gè)雜交瘤細(xì)胞由一每個(gè)雜交瘤細(xì)胞由一個(gè)個(gè)B細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞與一個(gè)骨髓瘤細(xì)胞融合細(xì)胞融合，僅合成和分泌抗單一抗原表位的特，僅合成和分泌抗單一抗原表位的特異性抗體，即單克隆抗體。異性抗體，即單克隆抗體。l優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)單一，特異性強(qiáng)，交叉反應(yīng)少。優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)單一，特異性強(qiáng)，交叉反應(yīng)少。問題n從從動(dòng)物動(dòng)物脾臟脾臟B細(xì)胞獲得的單克隆抗體（即細(xì)胞獲得的單克隆抗體（即鼠源鼠源性抗體性抗體）對(duì)人具有較強(qiáng)的免疫原性，會(huì)產(chǎn)生人）對(duì)人具有較強(qiáng)的免疫原性，會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體抗鼠抗體（HAMA)。n對(duì)單克隆抗體進(jìn)行改造，產(chǎn)生了對(duì)單克隆抗體進(jìn)行改造，產(chǎn)生了基因工程抗體基因工程抗體。

14、3、基因工程抗體、基因工程抗體（genetically engineered antibodies，gAb）n是通過基因工程技術(shù)獲得抗體，即通過是通過基因工程技術(shù)獲得抗體，即通過PCR技術(shù)獲得技術(shù)獲得抗體基因，與載體重組后，引入表達(dá)系統(tǒng)后，表達(dá)產(chǎn)抗體基因，與載體重組后，引入表達(dá)系統(tǒng)后，表達(dá)產(chǎn)生的抗體。生的抗體。n優(yōu)點(diǎn)：即保持了單抗的優(yōu)點(diǎn)：即保持了單抗的均一性、特異性強(qiáng)均一性、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，又的優(yōu)點(diǎn)，又能能克服其作為鼠源性抗體的不足克服其作為鼠源性抗體的不足。n簡(jiǎn)言之，基因工程抗體就是將人源抗體的編碼簡(jiǎn)言之，基因工程抗體就是將人源抗體的編碼基因克隆到真核或原核表達(dá)系統(tǒng)中，體外表達(dá)基因克隆到真核

15、或原核表達(dá)系統(tǒng)中，體外表達(dá)人源化抗體人源化抗體n其根本出發(fā)點(diǎn)是其根本出發(fā)點(diǎn)是解決抗體的鼠源性問題解決抗體的鼠源性問題。 第二節(jié)第二節(jié) 抗體分子的結(jié)構(gòu)和功能抗體分子的結(jié)構(gòu)和功能二、抗體的結(jié)構(gòu)二、抗體的結(jié)構(gòu)（一）基本結(jié)構(gòu)（一）基本結(jié)構(gòu)1.輕鏈（輕鏈（light chain，L鏈）鏈）l由由214個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子量25kD，同一抗，同一抗體分子上體分子上2條條L鏈總是相同。鏈總是相同。2.重鏈（重鏈（heavy chain，H鏈）鏈）l由由450570個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約5070kD。l每條每條H鏈含有鏈含有45個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵所組成

16、的環(huán)肽，為球形。個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵所組成的環(huán)肽，為球形。3.可變區(qū)（可變區(qū)（V區(qū)）和恒定區(qū)（區(qū)）和恒定區(qū)（C區(qū)）區(qū)）lV區(qū)區(qū)：近：近N-端輕鏈的端輕鏈的1/2區(qū)段、重鏈的區(qū)段、重鏈的1/4或或1/5區(qū)段的區(qū)段的氨基酸組成及排列順序多變，分為氨基酸組成及排列順序多變，分為VL和和VH。lC區(qū)區(qū)：近：近C-端輕鏈的端輕鏈的1/2區(qū)段、重鏈的區(qū)段、重鏈的3/4或或4/5區(qū)段的氨基區(qū)段的氨基酸組成較恒定酸組成較恒定,分為分為CH1、CH2、CH3。 n可變區(qū)可變區(qū)是指此區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗是指此區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗體中不同。體中不同。n恒定區(qū)恒定區(qū)是指此區(qū)域內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗是指此區(qū)域

17、內(nèi)的氨基酸序列在不同的抗體中相同。體中相同。 4.超變區(qū)（超變區(qū)（HVR區(qū)）和骨架區(qū)（區(qū)）和骨架區(qū)（FR）lHVR：可變區(qū)中，某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性：可變區(qū)中，某些特定位置的氨基酸殘基顯示更大的變異性。l它們共同組成抗原結(jié)合部位，該部位在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定它們共同組成抗原結(jié)合部位，該部位在空間結(jié)構(gòu)上可與抗原決定簇形成精密的互補(bǔ)。簇形成精密的互補(bǔ)。l也稱為也稱為互補(bǔ)決定區(qū)互補(bǔ)決定區(qū)（complementary-determining region，CDR），），分別稱為分別稱為CDR1，CDR2，CDR3。 lFR：可變區(qū)中氨基酸殘基變化小的部分，維持空間結(jié)構(gòu)：可變區(qū)中氨基

18、酸殘基變化小的部分，維持空間結(jié)構(gòu)。5.鉸鏈區(qū)（鉸鏈區(qū)（hinge region）lCH1和和CH2之間的區(qū)域。之間的區(qū)域。l含大量脯氨酸，具有彈性，易發(fā)生伸展及一定程度扭曲，含大量脯氨酸，具有彈性，易發(fā)生伸展及一定程度扭曲，有利于與抗原表位間的互補(bǔ)性結(jié)合。有利于與抗原表位間的互補(bǔ)性結(jié)合。 （二）功能區(qū)（二）功能區(qū) 1.抗體的功能區(qū)抗體的功能區(qū)l由一條多肽鏈折疊而成的球形結(jié)構(gòu)域稱為功能區(qū)。由一條多肽鏈折疊而成的球形結(jié)構(gòu)域稱為功能區(qū)。l每個(gè)功能區(qū)約由每個(gè)功能區(qū)約由110 個(gè)氨基酸組成，具有不同生物學(xué)個(gè)氨基酸組成，具有不同生物學(xué)功能。功能。 2.各功能區(qū)的功能各功能區(qū)的功能lVH和和VL共同構(gòu)成抗原

19、特異性結(jié)合部位。共同構(gòu)成抗原特異性結(jié)合部位。補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)補(bǔ)體結(jié)合位點(diǎn)借助借助CH2通過胎盤屏障通過胎盤屏障（三）水解片段（三）水解片段lIg分子中有些部位在一定條件下，容易被蛋白酶水解分子中有些部位在一定條件下，容易被蛋白酶水解為各種片段。常用的蛋白酶有為各種片段。常用的蛋白酶有木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶和和胃蛋白酶胃蛋白酶。lIg酶解的片段獲得，大大促進(jìn)了酶解的片段獲得，大大促進(jìn)了Ig分子結(jié)構(gòu)和功能的分子結(jié)構(gòu)和功能的研究，同時(shí)也為各種研究，同時(shí)也為各種基因工程抗體基因工程抗體的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。的構(gòu)建打下了基礎(chǔ)。如如DNA操作和抗體改型技術(shù)的發(fā)展，使得人們可根據(jù)操作和抗體改型技術(shù)的發(fā)展，使得人們可根

20、據(jù)抗體水解片段的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，產(chǎn)生更多有功能的抗體水解片段的結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，產(chǎn)生更多有功能的Ig改型分子片段改型分子片段 1.木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶l木瓜蛋白酶水解木瓜蛋白酶水解Ig分子可產(chǎn)生分子可產(chǎn)生2個(gè)個(gè)抗原結(jié)合片段抗原結(jié)合片段（fragment of antigen-binding，F(xiàn)ab）、）、一個(gè)一個(gè)可結(jié)晶可結(jié)晶片段（片段（fragment crystalizable，F(xiàn)c） 。lFc片段相當(dāng)于兩條重鏈的片段相當(dāng)于兩條重鏈的CH2和和CH3功能區(qū)，由二硫鍵連接，可功能區(qū)，由二硫鍵連接，可形形成結(jié)晶成結(jié)晶，其，其無抗原結(jié)合活性無抗原結(jié)合活性，但具，但具有固定補(bǔ)體、結(jié)合有固定補(bǔ)體、結(jié)合F

21、c受體等功能受體等功能 。lFab片段包括完整的輕鏈和部分重鏈（片段包括完整的輕鏈和部分重鏈（VH和和CH1），），能與一個(gè)抗原特異性結(jié)合，具有能與一個(gè)抗原特異性結(jié)合，具有單價(jià)單價(jià)抗體活性。抗體活性。可通過基因工程獲得可通過基因工程獲得Fab片段。片段。 2.胃蛋白酶胃蛋白酶l水解水解Ig分子可產(chǎn)生分子可產(chǎn)生1個(gè)個(gè)F（ab）2、若干個(gè)若干個(gè)裂解的小分裂解的小分子片段（子片段（pFc） 。l F（ab）2含有兩條含有兩條L鏈和略大于鏈和略大于Fab段的段的H鏈，由二鏈，由二硫鍵連接，具有硫鍵連接，具有雙價(jià)雙價(jià)抗體活性。抗體活性。四、抗體的功能四、抗體的功能（一）（一）V區(qū)的功能區(qū)的功能l識(shí)別并結(jié)

22、合抗原識(shí)別并結(jié)合抗原（二）（二）C區(qū)的功能區(qū)的功能l激活補(bǔ)體系統(tǒng)激活補(bǔ)體系統(tǒng)l介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性l穿過胎盤和粘膜穿過胎盤和粘膜第三節(jié)第三節(jié) 單克隆抗體的制備單克隆抗體的制備主要分為以下幾個(gè)步驟：主要分為以下幾個(gè)步驟：l抗原的制備抗原的制備l動(dòng)物的免疫動(dòng)物的免疫l抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤抗體產(chǎn)生細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞細(xì)胞l雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)與篩選雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)與篩選l大量制備單克隆抗體大量制備單克隆抗體一、單克隆抗體技術(shù)的基本原理一、單克隆抗體技術(shù)的基本原理lB淋巴細(xì)胞淋巴細(xì)胞能夠產(chǎn)生抗體，能夠產(chǎn)生抗體， 但在體外不能進(jìn)行無限分但在體外不能

23、進(jìn)行無限分裂裂; l而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代，而瘤細(xì)胞雖然可以在體外進(jìn)行無限傳代， 但不能產(chǎn)生但不能產(chǎn)生抗體。抗體。l將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本將這兩種細(xì)胞融合后得到的雜交瘤細(xì)胞具有兩種親本細(xì)胞的特性。細(xì)胞的特性。 兩類細(xì)胞融合物中存在以下細(xì)胞：兩類細(xì)胞融合物中存在以下細(xì)胞：l未融合的單核親本細(xì)胞（脾、瘤細(xì)胞）未融合的單核親本細(xì)胞（脾、瘤細(xì)胞）l同型融合多核細(xì)胞（脾同型融合多核細(xì)胞（脾-脾、瘤脾、瘤-瘤融合細(xì)胞）瘤融合細(xì)胞）l異型融合雙核細(xì)胞（脾異型融合雙核細(xì)胞（脾-瘤融合細(xì)胞）瘤融合細(xì)胞）雜交瘤細(xì)胞的篩選雜交瘤細(xì)胞的篩選l使用使用HAT（H為次黃嘌呤、為次黃嘌呤

24、、A為氨基蝶呤、為氨基蝶呤、T為為胸腺嘧啶核苷）培養(yǎng)基胸腺嘧啶核苷）培養(yǎng)基。 HAT篩選雜交瘤細(xì)胞的原理篩選雜交瘤細(xì)胞的原理l哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，DNA前體物的合成有兩種不同的途徑：前體物的合成有兩種不同的途徑： 從頭合成途徑從頭合成途徑：可被氨基蝶呤阻斷：可被氨基蝶呤阻斷 補(bǔ)救合成途徑補(bǔ)救合成途徑：需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（：需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT)或胸腺嘧啶核苷激酶（或胸腺嘧啶核苷激酶（TK)存在。存在。l骨髓瘤細(xì)胞株：從頭合成途徑被骨髓瘤細(xì)胞株：從頭合成途徑被A阻斷；是阻斷；是HGPRT缺陷缺陷（HGPRT-)和和TK缺陷（缺陷（TK-),不能利

25、用培養(yǎng)基中的不能利用培養(yǎng)基中的H和和T完成完成DNA的合成而死亡。的合成而死亡。二、抗原和免疫二、抗原和免疫（一）抗原的制備（一）抗原的制備1.提取純化天然抗原提取純化天然抗原l運(yùn)用蛋白質(zhì)等分離純化技術(shù)分離蛋白質(zhì)分子運(yùn)用蛋白質(zhì)等分離純化技術(shù)分離蛋白質(zhì)分子作為抗原。作為抗原。l對(duì)于含量低的蛋白分離純化成本高，目前已對(duì)于含量低的蛋白分離純化成本高，目前已少用。少用。2.用基因工程技術(shù)制備重組蛋白抗原用基因工程技術(shù)制備重組蛋白抗原l可獲得足夠數(shù)量蛋白抗原。可獲得足夠數(shù)量蛋白抗原。l原核原核系統(tǒng)只能提供連續(xù)氨基酸表位的抗原。系統(tǒng)只能提供連續(xù)氨基酸表位的抗原。l真核真核及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞系

26、統(tǒng)可解決抗原構(gòu)象表可解決抗原構(gòu)象表位位，但產(chǎn)量低，成本過高。，但產(chǎn)量低，成本過高。3.合成多肽半抗原合成多肽半抗原l根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列，經(jīng)人工根據(jù)抗原蛋白的氨基酸序列，經(jīng)人工合成抗合成抗原表位的多肽片段原表位的多肽片段，即多肽半抗原。，即多肽半抗原。l該方法效率高、成本低，已成為抗原制備的該方法效率高、成本低，已成為抗原制備的主要來源。主要來源。 半抗原半抗原：只有反應(yīng)原性而無免疫原性的物質(zhì)。其可與抗體或致敏淋：只有反應(yīng)原性而無免疫原性的物質(zhì)。其可與抗體或致敏淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合，但不能單獨(dú)誘發(fā)免疫應(yīng)答。巴細(xì)胞特異性結(jié)合，但不能單獨(dú)誘發(fā)免疫應(yīng)答。 n小分子半抗原小分子半抗原 抗生素（青霉素

27、等）、農(nóng)藥、重金屬等屬于小抗生素（青霉素等）、農(nóng)藥、重金屬等屬于小分子半抗原。分子半抗原。n多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯(lián)多肽半抗原及小分子半抗原與載體偶聯(lián) 載體如牛血清清蛋白（載體如牛血清清蛋白（BSA)等。等。（二）動(dòng)物及免疫（二）動(dòng)物及免疫l免疫接種的目的是使免疫接種的目的是使B細(xì)胞在特異性抗原刺激細(xì)胞在特異性抗原刺激下分化、增殖、分泌特異性抗體。下分化、增殖、分泌特異性抗體。1.動(dòng)物的選擇動(dòng)物的選擇l一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免一般采用與骨髓瘤供體同一品系的動(dòng)物進(jìn)行免疫。疫。l常用的骨髓瘤品系來自常用的骨髓瘤品系來自Balb/c小鼠和小鼠和Lou大鼠，大鼠，免疫動(dòng)物也采

28、用相應(yīng)品系。免疫動(dòng)物也采用相應(yīng)品系。Balb/c小鼠小鼠2.免疫免疫方法方法l有有體內(nèi)、體外體內(nèi)、體外和和脾內(nèi)免疫脾內(nèi)免疫法。法。l體內(nèi)體內(nèi)免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多。免疫法適用于免疫原性強(qiáng)、抗原量較多。l體外體外免疫免疫 體外免疫是指在一定條件下，在體外將正常脾細(xì)體外免疫是指在一定條件下，在體外將正常脾細(xì)胞與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。胞與抗原共同培養(yǎng)，然后再與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。 體外免疫方法體外免疫方法n分離小鼠脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，分離小鼠脾細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，RPMI1640培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液中，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原，加適量滋養(yǎng)細(xì)胞與抗原，37度度 5CO2培養(yǎng)培養(yǎng)3天。

29、天。n體外免疫方案免疫效果不如其它方案，僅用于抗原量體外免疫方案免疫效果不如其它方案，僅用于抗原量極少，抗原免疫原性弱的抗原。極少，抗原免疫原性弱的抗原。 用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況。用于不能采用體內(nèi)免疫法的情況。l脾內(nèi)脾內(nèi)免疫免疫 小鼠麻醉后，打開腹腔，沿脾臟長(zhǎng)軸方向緩小鼠麻醉后，打開腹腔，沿脾臟長(zhǎng)軸方向緩慢注入慢注入0.1-0.2ml可溶性抗原，免疫后可溶性抗原，免疫后34d即可即可取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。取脾細(xì)胞進(jìn)行融合。 目前最常用的是體內(nèi)免疫法。目前最常用的是體內(nèi)免疫法。3.乳化乳化l為增強(qiáng)免疫原性，常加入佐劑（弗氏佐劑）。為增強(qiáng)免疫原性，常加入佐劑（弗氏佐劑）。l初次免疫時(shí)，抗原需要與

30、一定量弗氏完全佐劑初次免疫時(shí)，抗原需要與一定量弗氏完全佐劑混合，經(jīng)乳化后應(yīng)用。混合，經(jīng)乳化后應(yīng)用。l加強(qiáng)免疫時(shí)，可以用不完全佐劑，或不用佐劑。加強(qiáng)免疫時(shí)，可以用不完全佐劑，或不用佐劑。弗氏完全佐劑弗氏完全佐劑 n由油劑（石蠟油或植物油）由油劑（石蠟油或植物油） 、n乳化劑（羊毛脂或吐溫（乳化劑（羊毛脂或吐溫（Tween）80）n滅活的分枝桿菌（卡介苗）組成。滅活的分枝桿菌（卡介苗）組成。 有比較強(qiáng)烈的刺激免疫系統(tǒng)，被免疫系統(tǒng)有比較強(qiáng)烈的刺激免疫系統(tǒng)，被免疫系統(tǒng)認(rèn)為是外界物質(zhì)的作用。能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)認(rèn)為是外界物質(zhì)的作用。能刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答。答。 弗氏不完全佐劑弗氏不完全佐劑 n只有石蠟油

31、和羊毛脂，缺少滅活的結(jié)核菌的弗只有石蠟油和羊毛脂，缺少滅活的結(jié)核菌的弗氏佐劑。氏佐劑。 弗氏完全佐劑用于初次免疫刺激。弗氏不完弗氏完全佐劑用于初次免疫刺激。弗氏不完全佐劑用于加強(qiáng)免疫。全佐劑用于加強(qiáng)免疫。 乳化乳化n用佐劑將抗原包裹使之形成油包水乳劑。用佐劑將抗原包裹使之形成油包水乳劑。n乳化方法有：乳缽研磨、機(jī)械攪拌等。乳化方法有：乳缽研磨、機(jī)械攪拌等。4.體內(nèi)免疫途徑體內(nèi)免疫途徑l皮下、腹腔和靜脈注射等（抗原量多）。皮下、腹腔和靜脈注射等（抗原量多）。l皮下、皮內(nèi)和足掌等多點(diǎn)注射（抗原量少）。皮下、皮內(nèi)和足掌等多點(diǎn)注射（抗原量少）。體內(nèi)免疫后藥物吸收進(jìn)入血液。體內(nèi)免疫后藥物吸收進(jìn)入血液。5

32、.免疫程序免疫程序初次免疫初次免疫（Ag100-500ug加弗氏完全佐劑注射）加弗氏完全佐劑注射）第二次免疫第二次免疫（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）加強(qiáng)免疫（融合前免疫）加強(qiáng)免疫（融合前免疫）無菌取脾，制備脾細(xì)胞無菌取脾，制備脾細(xì)胞第三次免疫第三次免疫（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）（劑量同上，加弗氏不完全佐劑注射）4周后周后4周后周后5-7天采血，檢測(cè)抗體效價(jià)，天采血，檢測(cè)抗體效價(jià)，2周后周后3天后天后三、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的選擇三、細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的選擇l細(xì)胞融合細(xì)胞融合（cell fusion）是）是2個(gè)或個(gè)或2個(gè)以上個(gè)以上的細(xì)的細(xì)胞合并成一

33、個(gè)細(xì)胞的過程。胞合并成一個(gè)細(xì)胞的過程。l免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞+骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞=雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞。l所需要的細(xì)胞：免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)所需要的細(xì)胞：免疫動(dòng)物的脾細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、飼養(yǎng)細(xì)胞。胞、飼養(yǎng)細(xì)胞。（一）細(xì)胞的準(zhǔn)備（一）細(xì)胞的準(zhǔn)備1. 免疫脾細(xì)胞免疫脾細(xì)胞l指處于免疫狀態(tài)脾臟中的指處于免疫狀態(tài)脾臟中的B淋巴母細(xì)胞。淋巴母細(xì)胞。l取取加強(qiáng)免疫以后加強(qiáng)免疫以后3天天的脾臟制備的脾臟制備B淋巴母細(xì)胞。淋巴母細(xì)胞。此時(shí)，脾臟體積是正常鼠脾臟體積的此時(shí)，脾臟體積是正常鼠脾臟體積的2倍，倍，B淋巴母細(xì)胞比例較大，融合成功率較高淋巴母細(xì)胞比例較大，融合成功率較高。免疫脾細(xì)胞制

34、備操作步驟免疫脾細(xì)胞制備操作步驟小鼠最后一次加強(qiáng)免疫小鼠最后一次加強(qiáng)免疫3天后，摘除眼球取血天后，摘除眼球取血斷頸處死，浸泡于斷頸處死，浸泡于75%酒精消毒酒精消毒無菌剪刀分離脾臟無菌剪刀分離脾臟脾臟用脾臟用RPMI培養(yǎng)液洗滌一次，制成細(xì)胞懸液培養(yǎng)液洗滌一次，制成細(xì)胞懸液曬網(wǎng)過濾，細(xì)胞計(jì)數(shù)曬網(wǎng)過濾，細(xì)胞計(jì)數(shù)離心，棄上清離心，棄上清培養(yǎng)液重懸，冰水浴中備用培養(yǎng)液重懸，冰水浴中備用2. 骨髓瘤細(xì)胞骨髓瘤細(xì)胞l融合前兩周開始復(fù)蘇。融合前兩周開始復(fù)蘇。l培養(yǎng)基培養(yǎng)基RPMI1640、DMEM均可作為其培養(yǎng)基，均可作為其培養(yǎng)基，小牛血清的濃度一般在小牛血清的濃度一般在1020%,1:10傳代稀釋。傳代稀

35、釋。l活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于活細(xì)胞計(jì)數(shù)高于95%，以保證骨髓瘤細(xì)胞處于，以保證骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3. 飼養(yǎng)細(xì)胞（飼養(yǎng)細(xì)胞（feeder cell）l加入的目的在于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。加入的目的在于促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖。l能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞能滿足雜交瘤細(xì)胞對(duì)細(xì)胞密度的依賴性密度的依賴性，能釋，能釋放某些生長(zhǎng)刺激因子。放某些生長(zhǎng)刺激因子。l常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。和胸腺細(xì)胞等。小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備操作步驟（融合前小鼠腹腔巨噬細(xì)胞制備操作步驟（融合前2-3天制備）天制備）Balb/c小鼠小鼠斷頸處死，浸泡于斷頸處死，浸泡

36、于75%酒精消毒酒精消毒無菌剪刀剪開腹腔，暴露腹膜無菌剪刀剪開腹腔，暴露腹膜無菌注射器注入腹腔培養(yǎng)液無菌注射器注入腹腔培養(yǎng)液8-12ml反復(fù)沖洗，吸出沖洗液反復(fù)沖洗，吸出沖洗液離心，棄上清離心，棄上清培養(yǎng)液重懸，加入培養(yǎng)液重懸，加入96孔板，孔板，37度，度，CO2孵箱培養(yǎng)備用孵箱培養(yǎng)備用（二）脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合（二）脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合l取適量取適量脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞（3:15:1）進(jìn)行）進(jìn)行混合，在聚乙二醇作用下誘導(dǎo)融合，混合，在聚乙二醇作用下誘導(dǎo)融合，2min左左右右。lPEG濃度越高，促融率越大，但毒性也越大。濃度越高，促融率越大，但毒性也越大。常用濃度常

37、用濃度4050%，分子量，分子量4kD。l常用方法有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。常用方法有轉(zhuǎn)動(dòng)法和離心法。l細(xì)胞融合流程圖細(xì)胞融合流程圖將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在離心管中混合將脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在離心管中混合培養(yǎng)液洗培養(yǎng)液洗1次，離心，棄上清次，離心，棄上清吸盡殘留液體，吸盡殘留液體，37水浴，水浴，加入細(xì)胞融合劑加入細(xì)胞融合劑加入不完全培養(yǎng)液，終止融合劑的作用加入不完全培養(yǎng)液，終止融合劑的作用離心，棄上清離心，棄上清用含用含20小牛血清小牛血清RPMI1640（含（含HAT）融合后細(xì)胞懸液加入融合后細(xì)胞懸液加入96孔板，孵箱培養(yǎng)孔板，孵箱培養(yǎng)（三）（三）HAT選擇雜交瘤細(xì)胞選擇雜交瘤細(xì)胞l在在HAT培養(yǎng)基中

38、，次日即可觀察到骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)基中，次日即可觀察到骨髓瘤細(xì)胞相繼死亡。相繼死亡。l融合后融合后3-4天可在鏡下觀察到細(xì)胞克隆的形成。天可在鏡下觀察到細(xì)胞克隆的形成。四、篩選陽(yáng)性克隆及克隆化四、篩選陽(yáng)性克隆及克隆化l篩選陽(yáng)性克隆篩選陽(yáng)性克隆（screening）：即篩選能分泌特：即篩選能分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞。異性單抗的雜交瘤細(xì)胞。l方法：是用抗原分別檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞中分泌的方法：是用抗原分別檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞中分泌的抗體，常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體，常用的方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA)、放射免疫測(cè)定、放射免疫測(cè)定（radioimmunoassay，RIA）等）等。ELISA法的原理法

39、的原理n其基本方法是將已知的抗體或抗原吸附在固相載體表面。其基本方法是將已知的抗體或抗原吸附在固相載體表面。n加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過反應(yīng)也結(jié)合在固相載體上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，上。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA 實(shí)驗(yàn)流程示圖實(shí)驗(yàn)流程示圖 l酶的催化效率很高，間接地酶的催化效率很高，間接地放大放大了免疫反應(yīng)的了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測(cè)定方法達(dá)到很高的結(jié)果

40、，使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度敏感度。l免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平。水平。例例如：用酶免疫測(cè)定法測(cè)定口蹄疫抗體，其敏感如：用酶免疫測(cè)定法測(cè)定口蹄疫抗體，其敏感度可達(dá)度可達(dá)0.1ng/ml。操作程序 加抗體包被加抗體包被 4過夜，洗滌三次、拋干過夜，洗滌三次、拋干 加待檢抗原加待檢抗原 37 30分鐘，洗滌三次、拋干分鐘，洗滌三次、拋干 加酶標(biāo)抗體加酶標(biāo)抗體 37 30分鐘，洗滌三次、拋干分鐘，洗滌三次、拋干 加底物液加底物液 37 15分鐘，加終止液分鐘，加終止液 用用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定檢測(cè)儀測(cè)定OD值。值。酶標(biāo)板酶標(biāo)板 n酶標(biāo)板酶標(biāo)板(ELISA PL

41、ATE):在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)中中,作為載體的作為載體的固相聚苯乙烯固相聚苯乙烯(Polystyrene)表面對(duì)抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物的吸附也起表面對(duì)抗原、抗體或抗原抗體復(fù)合物的吸附也起著重要作用。著重要作用。 n酶標(biāo)板根據(jù)其孔數(shù)可以分為酶標(biāo)板根據(jù)其孔數(shù)可以分為48孔，孔，96孔。一般常用的為孔。一般常用的為96孔。孔。 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀n即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀即酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀,是是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的專用儀器的專用儀器. 其其工作原理基本上都是一致的工作原理基本上都是一致的,其核心都是一

42、個(gè)其核心都是一個(gè)比色計(jì)比色計(jì),即用即用比色法來分析抗原或抗體的含量比色法來分析抗原或抗體的含量. 酶標(biāo)儀酶標(biāo)儀（二）雜交瘤細(xì)胞的克隆（二）雜交瘤細(xì)胞的克隆（cloning）l是指將陽(yáng)性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來。是指將陽(yáng)性孔中分泌抗體的單個(gè)細(xì)胞分離出來。l方法：方法：l克隆化的原則：對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)克隆化的原則：對(duì)于檢測(cè)陽(yáng)性的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)盡早克隆化。盡早克隆化。 有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，有限稀釋法：把雜交瘤細(xì)胞懸液稀釋后，加入到加入到96孔板，每孔一個(gè)細(xì)胞。孔板，每孔一個(gè)細(xì)胞。（三）雜交瘤細(xì)胞的凍存（三）雜交瘤細(xì)胞的凍存l及時(shí)凍存原始孔的雜交瘤細(xì)胞是很有必要的。及時(shí)凍

43、存原始孔的雜交瘤細(xì)胞是很有必要的。l細(xì)胞凍存液：細(xì)胞凍存液：50%小牛血清，小牛血清，40%不完全培養(yǎng)不完全培養(yǎng)液和液和10%DMSO。l方法：室溫降到方法：室溫降到0，再降到，再降到-70 ，轉(zhuǎn)入液氮，轉(zhuǎn)入液氮中。中。六、單克隆抗體的大量制備六、單克隆抗體的大量制備l體內(nèi)培養(yǎng)法體內(nèi)培養(yǎng)法 利用活體動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，將雜交瘤利用活體動(dòng)物作為生物反應(yīng)器，將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠或大鼠的腹腔內(nèi)生長(zhǎng)并分泌單細(xì)胞注射到小鼠或大鼠的腹腔內(nèi)生長(zhǎng)并分泌單抗。抗。 方法是：腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，方法是：腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，710天后天后抽取腹水，離心，得上清液。抽取腹水，離心，得上清液。降植烷降植烷 n降植烷是

44、一種降植烷是一種免疫抑制劑免疫抑制劑。n所以，提前一周注射降植烷、液體石蠟等免疫所以，提前一周注射降植烷、液體石蠟等免疫抑制劑，總的來說是為了提高單克隆抗體產(chǎn)生抑制劑，總的來說是為了提高單克隆抗體產(chǎn)生的效率。的效率。 l體外培養(yǎng)法體外培養(yǎng)法 體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從細(xì)胞體外使用旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中獲得抗體。培養(yǎng)上清液中獲得抗體。 該方法獲得的抗體產(chǎn)量較體內(nèi)培養(yǎng)法低。該方法獲得的抗體產(chǎn)量較體內(nèi)培養(yǎng)法低。七、單克隆抗體的純化七、單克隆抗體的純化n澄清和沉淀處理：離心沉淀，過濾，蛋白沉淀。澄清和沉淀處理：離心沉淀，過濾，蛋白沉淀。n分離純化：層析技術(shù)。分離純化

45、：層析技術(shù)。第四節(jié)第四節(jié) 基因工程抗體基因工程抗體單克隆抗體的缺點(diǎn)單克隆抗體的缺點(diǎn)n絕大多數(shù)來源于小鼠或大鼠。絕大多數(shù)來源于小鼠或大鼠。n人體使用鼠抗體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體，產(chǎn)生超敏反應(yīng)。人體使用鼠抗體會(huì)產(chǎn)生人抗鼠抗體，產(chǎn)生超敏反應(yīng)。解決辦法解決辦法n制備人源性抗體，但人制備人源性抗體，但人-人雜交瘤技術(shù)未實(shí)現(xiàn)突破。人雜交瘤技術(shù)未實(shí)現(xiàn)突破。基因工程抗體基因工程抗體n制備抗體基因，與載體連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)抗制備抗體基因，與載體連接后導(dǎo)入受體細(xì)胞，表達(dá)抗體。體。基因工程抗體包括基因工程抗體包括l抗體抗體l抗體片段抗體片段l抗體偶聯(lián)物抗體偶聯(lián)物l抗體融合蛋白等抗體融合蛋白等一、一、Fab與與Fvl

46、Fab抗體片段抗體片段l由重鏈由重鏈V區(qū)及區(qū)及CH1功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵功能區(qū)與整個(gè)輕鏈以二硫鍵形式連接而成。形式連接而成。lFv抗體片段抗體片段n由一個(gè)由一個(gè)VH和一個(gè)和一個(gè)VL組成。組成。n通過通過非共價(jià)鍵結(jié)合非共價(jià)鍵結(jié)合組成，是抗體中具有完整抗組成，是抗體中具有完整抗原結(jié)合活性的最小功能片段。原結(jié)合活性的最小功能片段。n分子片段小，免疫原性弱，對(duì)實(shí)體瘤的穿透性分子片段小，免疫原性弱，對(duì)實(shí)體瘤的穿透性強(qiáng)。強(qiáng)。Fvn可作為靶向載體藥物、毒素等結(jié)合，用于腫瘤可作為靶向載體藥物、毒素等結(jié)合，用于腫瘤的治療。的治療。l二硫鍵穩(wěn)定的二硫鍵穩(wěn)定的Fv（disulfide-stablized，dsF

47、v）n由一個(gè)由一個(gè)VH和一個(gè)和一個(gè)VL組成。組成。n是在是在VH和一個(gè)和一個(gè)VL 的適當(dāng)位置各的適當(dāng)位置各引入一個(gè)半胱引入一個(gè)半胱氨酸氨酸，形成，形成dsFv 。n二硫鍵遠(yuǎn)離二硫鍵遠(yuǎn)離CDRs互補(bǔ)決定區(qū)，不會(huì)影響與抗互補(bǔ)決定區(qū)，不會(huì)影響與抗原的結(jié)合原的結(jié)合 。二、單鏈抗體二、單鏈抗體（Single chain Fv ，ScFv）n是利用是利用DNA重組技術(shù)將抗體的一條重組技術(shù)將抗體的一條VH和和VL基基因，通過一條短肽鏈因，通過一條短肽鏈(一般為一般為15 個(gè)氨基酸個(gè)氨基酸)連接連接后表達(dá)出來的抗體片段。后表達(dá)出來的抗體片段。單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)是單鏈抗體的優(yōu)點(diǎn)是:n只含有只含有V區(qū)，不含區(qū)，不含F(xiàn)

48、c段，不與非靶細(xì)胞結(jié)合，可作為段，不與非靶細(xì)胞結(jié)合，可作為藥物的導(dǎo)向載體。藥物的導(dǎo)向載體。n分子小，容易進(jìn)入組織分子小，容易進(jìn)入組織( 包括腫瘤包括腫瘤) ,因而可用于腫瘤因而可用于腫瘤的診斷和治療的診斷和治療; n因其為單鏈因其為單鏈, 易于進(jìn)行分子改造易于進(jìn)行分子改造,如與毒素等拼接成為如與毒素等拼接成為免疫毒素免疫毒素,可以直接殺傷靶細(xì)胞可以直接殺傷靶細(xì)胞;n可由大腸桿菌等發(fā)酵可由大腸桿菌等發(fā)酵,進(jìn)行大批量生產(chǎn)，優(yōu)于完整抗進(jìn)行大批量生產(chǎn)，優(yōu)于完整抗體。體。3.單鏈抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用單鏈抗體在腫瘤治療中的應(yīng)用 構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素（構(gòu)建和生產(chǎn)免疫毒素（immunotoxin）n免疫毒素：抗體與毒素的偶聯(lián)物免疫毒素：抗體與毒素的偶聯(lián)物n可將毒素定位于靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。可將毒素定位于靶細(xì)胞，對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行特異性殺傷。n是將單鏈抗體基因是將單鏈抗體基因C末端與毒素基因相連，經(jīng)表達(dá)后末端與毒素基因相連，經(jīng)表達(dá)后獲得獲得scFv與毒素的融合蛋白。常用的毒素有綠膿桿菌與