1、精選優質文檔-傾情為你奉上1.分子診斷學:是以分子生物學理論為基礎，利用分子生物學的技術和方法來研究人體內源性或外源性生物大分子和2.SNP：單核苷酸多態性，指在基因組上單個核苷酸的變異，形成的遺傳標記，其數量很多，多態性豐富。3基因(gene)：是有功能的DNA片段，含有合成有功能蛋白質多肽鏈或RNA所必學的全部核苷酸序列，是遺傳的結構和功能單位。分為結構基因和調控基因。4結構基因：編碼蛋白質或RNA的編碼序列 調控基因：保證轉錄功能起調控作用的非編碼序列5操縱子（operon）操縱基因與其控制下的結構基因共同組成的功能單位6斷裂基因：指基因的內部存在間隔區，間隔區的DNA序列與該基因所決定

2、的蛋白質沒有關系。間隔區又稱為內含子。出現在成熟RNA中的有效區段為外顯子。7.重疊基因：指基因的開放閱讀框（ORF）存在一個或多個核苷酸重疊的基因8.跳躍基因：又稱轉座子，基因在染色體上的位置不固定，能由一條染色體跳到另一條染色體上。9.必須基因：生物體中存在的一些維持生物細胞生長所必需的基因，缺少或突變這些基因均能導致生物體死亡10.基因組（genome）：細胞中一套完整單倍體的遺傳物質的總和. 11.基因組結構主要指不同的DNA功能區在DNA分子中的分布和排列12多順反子（polycistron）：操縱子中常常有一至多個功能相關的結構基因串連一起，受同一個調控區調控，轉錄在同一個mRNA

3、分子中。13.黏性末端：基因組雙鏈兩端具有能夠互補的單鏈DNA部分 14.末端正向重復序列：又稱末端冗余，指病毒雙鏈DNA分子兩端有一段相同的核苷酸 15.末端反向重復序列（ITR）：指病毒基因組兩端的反向互補重復序列 16.重疊基因：指兩個或兩個以上基因的ORF共有一段DNA序列 17.分段基因：指病毒基因組由幾條不同的核酸分子組成，多冗于tDNA病毒，RNA病毒及雙鏈RNA病毒 18.LTR：即長末端重復序列，逆轉錄病毒逆轉錄后生產的dsDNA中，兩端有LTR結構19.DNA重組：是指將不同來源的DNA分子通過磷酸二酯鍵將末端連接形成重組DNA.20.DNA克隆（分子克隆）：將某一特定DN

4、A片段通過重組DNA技術插入到一個載體（質粒和病毒等）中，然后在宿主細胞中進行自我復制所得到的大量完全相同的該DNA片段的群體。21.限制性片段長度的多態性（RFLP）：個體之間DNA的核苷酸序列存在差異，稱為DNA多態性。若因此而改變了限制性內切酶的酶切位點可導致相應的限制性片段的長度和數量發生變化，稱RFLP。22.限制性核酸內切酶（RE）:重要的工具酶之一。RE是一類能識別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶.(水解磷酸二酯鍵)23.DNA聚合酶 是從大腸桿菌中發現的第一個DNA聚合酶，分子量為.具有3聚合酶活性、35核酸外切酶活性 、5-3核算外切酶活性的工具酶。24.Kleno

5、w片段：用特異性的蛋白酶可將DNA聚合酶 裂解為小片段與大片段，大片段即Klenow片段，具有5-3聚合酶活性及3-5外切酶活性，而失去了53外切酶活性，是分子生物學研究的常用工具酶25.TaqDNA聚合酶：一種耐熱的依賴DNA的聚合酶。具有53聚合酶活性和依賴于聚合作用的53外切酶活性。（最佳作用溫度是7080，TaqDNA聚合酶可用于DNA測定及通過聚合酶鏈反應（PCR）對DNA分子的特定序列進行體外擴增）26.同工異源酶：在DNA上，來源不同但能識別和切割同一位點的酶。27.逆轉錄酶：是具有依賴RNA的DNA聚合酶活性、核酸酶H的水解作用、以DNA為模版的DNA聚合酶作用的多功能酶。28

6、.末端脫氧核糖核苷酰轉移酶（簡稱末端轉移酶）TdT：在二價陽離子存在下，催化轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3'-OH末端的工具酶。29.連接酶：催化雙鏈一端的與另一雙鏈'端的磷酸根形成'，磷酸二酯鍵，將具有相同黏性末端或平端的兩條雙鏈DNA片段連接起來，實現DNA的體外重組，其催化黏性末端連接效率要比平末端高得多。30.堿性磷酸酶：用于催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基團的工具酶。31.T4多核苷酸激酶：來源于T4噬菌體感染的大腸桿菌 包括前向反應和交換反應。用于催化ATP上的-磷酸轉移到鏈的端上的工具酶32.核酸酶：可用于水解雙鏈DNA、或DNA雜

7、交分子的單鏈部分的工具酶33.載體（vector）：是攜帶靶DNA（目的DNA）片段進入宿主細胞進行擴增和表達的運載工具，本質為DNA。34.克隆載體：能將目的基因在受體細胞中復制擴增并產生大量目的基因的載體稱為克隆載體。35.分子診斷主要特點：直接以疾病基因為探索對象，屬于病因學診斷，對基因的檢測結果不僅具有描述性，更具有準確性；可準確診斷疾病的基因型變異，基因表型異常以及由外源性基因侵入引起的疾病；靈敏度高，便于早期診斷及疾病預防；以基因分析為基礎，特異性高。36分子診斷三個階段:(第一個階段：準備和醞釀階段 1953年前，蛋白質是生命的物質基礎，DNA是遺傳物質基礎。（三個實驗：肺炎雙球

8、菌轉化實驗、體外轉化實驗、噬菌體轉導實驗）、第二個階段：DNA雙螺旋結構、中心法則、PCR技術第三個階段：2001年，首張人類基因組序列圖譜及其他物種基因組序列的公布。基因組分、蛋白質組學等方面的巨大技術進步，促進進入第三階段，即以生物芯片技術為代表的高通量密集型技術。主要應用：感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤的分子診斷，個體化醫療，其他如耐藥性、療效監測，多基因疾病37.四項生物技術：細胞融合技術，分子克隆技術，蛋白工程技術，基因擴增技術38.C值：基因組的大小，常用堿基數目或堿基對數目來描述C值是特異的，物種不同，差異極大， 真核生物中，一般隨著進化，C值增大C值矛盾：又稱C值悖論，生物的進化

9、程度與基因組大小不完全成比例的現象39.真核生物基因組基本特征：有細胞核基因組和細胞器基因組之分；核基因組以線狀DNA分子的形式存在于染色質上；基因多數為斷裂基因，有內含子結構和大量重復序列；單順反子，基因家族；核基因組由染色體DNA組成，分子量較大，結構復雜，與蛋白質結合。40.注意點：染色質的基本組成單位是核小體，由組蛋白核心和周圍的DNA組成。組蛋白H2A、H2B、H3和H4各2個分子組成核心即組蛋白八聚體一個基因有n個內含子，則相應有n+1個外顯子重復序列分為4類：單一序列、輕度重復序列（210個拷貝）、中度重復序列（1012個拷貝）、高度重復序列（1萬以上）多基因家族：一些有編碼功能

10、的重復序列，即指起源相同，序列相似，功能相關的的一組基因，分為基因簇（相對集中分布在某一染色體的特定區域）和另一類基因家族成員在整個染色體上散在分布，甚至位于不同染色體超基因家族：由基因家族和單基因組成的較大的基因家族，結構不等的同源性，功能不一定相同假基因：基因家族中有的成員因突變而失活，不能表達出有活性的產物。41人類基因組計劃（HGP）：旨在測出人類基因組30億堿基對的核苷酸序列，發現所有人類基因并確定它們在染色體上的位置，破譯人類全部遺傳信息，發展基因組學新技術，探討人類基因組研究的社會法律與倫理等問題的一個國際性研究項目。1） 主要任務：人類的DNA測序，包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理

11、圖譜、轉錄圖譜等的繪制2）測序策略：經典的逐步克隆法、全基因組鳥槍法 3）人類基因組概貌：GC含量：平均41%（33%65%）CpG島：即二核苷酸CG染色體的重組率 基因突變率：男性多見重組序列的含量，包括SINE、LINE、LTR、衛星DNA、Tn等單核苷酸多態性（SNP）含量基因數量：2、6萬3、9萬個蛋白質數量：選擇性剪接較多，使得蛋白質多而復雜疾病基因 人基因組序列：99、99%相同 4）人類基因組多樣性：同一人種或不同人種基因組存在或多或少的差異。 通常DNA分子中某一特定位點的變異頻率低于1%為基因突變，高于1%為DNA分子多肽。人類DNA分子多肽性的產生有以下幾種主要方式：重復序

12、列單元的拷貝數變異，如微衛星DNA多態性 轉座因子導致的分子多肽，如Alu序列多態性單個核苷酸的變異即SNP 42原核生物基因組一般特點：基因組相對較小，通常為一條雙鏈DNA分子 功能相關的基因高度集中，構成操縱子重復序列少，大多數的蛋白質基因保持單拷貝形式，RNA基因常是多拷貝沒有內含子，基因連續多順反子，構成轉錄單位絕大部分DNA都是用于編碼蛋白質的，只有很少不編碼序列DNA分子中有各種功能區43、質粒是多數細菌和某些真核生物細胞的染色體外的雙鏈環狀DNA分子44.遺傳特性：雙鏈環狀DNA分子，且為共價閉合環狀DNA（cccDNA）質粒復制有賴于宿主細胞的復制，但其自身基因可控制合成的時限

13、及拷貝數垂直傳遞 不影響宿主細胞代謝，但可能賦予宿主細胞新的表型治理的復制方式為半保留復制。單向/雙向，單向，雙向。45.特性：質粒的不相溶性：兩種不同質粒如果利用同一復制和維持機制，會在復制和隨后向子代細胞分配的過程中相互競爭，因而不能在同一宿主細胞內穩定存在，其中一種質粒將被丟失的現象。這兩種質粒屬于同一不相容群（InC）。質粒的穩定性：質粒在宿主細胞內能穩定存在不被丟失稱為質粒的穩定性。質粒的轉移性。質粒的 選擇性標記。46.質粒的拷貝數：在正常生長條件下，每個宿主細胞或每條染色體所對應的平均質粒數。由其攜帶的復制子決定。復制子是一個復制單位，包括復制起點及其相關的調控元件。質粒的復制由

14、復制子與調節因子協同作用來啟動。47.松弛型質粒：以RNA為調節因子的質粒的復制不需任何自身編碼的蛋白質，完全由宿主細胞提供的壽命較長的酶及其他蛋白質因子來完成，這些質粒的復制不受宿主細胞的控制，以所謂的“松弛”方式進行。屬高拷貝質粒。48.嚴緊型質粒：攜帶與蛋白質調節因子相互作用的復制子的質粒。屬低拷貝質粒。49.轉座因子：又稱可轉座元件，指能在基因組中從一個位點移至另一位點的DNA序列。1）轉座現象或移位：指由可移動因子介導的遺傳物質重排現象。轉座作用結果：a.導致宿主細胞基因組DNA的插入突變或基因重排，是毗鄰基因失活或表達水平下降。b.轉座因子被認為是基因組進化的重要推動力量，還可作為

15、遺傳學研究及基因工程的工具。2）原核生物轉座因子的種類：插入序列（IS）、轉座子（Tn）、可轉移性噬菌體。IS：a.IS兩端有正向重復序列（DR）和反向重復序列（IR）；b.IR結構的對稱使IS既可正向插入靶位點，也可反向插入靶位點；c.IS的中間位編碼序列，僅編碼與轉座有關的酶，含有依賴p因子的轉錄終止信號及終止密碼，從而導致插入位點的基因失活或表達水平下降。Tn：基因組中存在的能自主復制和位移的一些DNA序列。特點：a.兩端有反向重復序列；b.轉座后靶位點重復序列是正向重復序列；c.編碼與轉座有關的蛋白；d.可以在基因組中移動。50.轉座類型：復制型轉座、非復制型轉座。復制型轉座：轉座因子

16、在轉座過程中能夠復制，結果是供體與受體都有一個拷貝的轉座因子。需轉座酶和解離酶。非復制型轉座：轉座因子不復制，直接從一個位點移到另一個位點，結果是供體失去一個轉座因子而受體得到一個轉座因子。需轉座酶。51.病毒基因組：1)特點：只有一種核酸，4種類型，為雙鏈DNA、單鏈DNA、雙鏈RNA、單鏈RNA 核酸大小差別較大（1.3×103bp3.6×106bp） 具有啟動子和操縱子結構 具有重疊結構2）結構：帽子和poly（A）尾結構，對RNA起保護作用，并于病毒感染性有關 52.分子克隆技術中，常用的工具酶有：限制性核酸內切酶，DNA聚合酶,逆轉錄酶，DNA連接酶，堿性磷酸酶，

17、多核苷酸激酶等。53.限制性核酸內切酶（RE）命名：Hind H產生該酶的宿主菌屬名大寫，斜體in代表宿主菌的種名縮寫小寫，斜體d代表宿主菌的株或型正體代表同一種菌株中不同限制酶的編號（按發現先后順序）羅馬數字。回問結構：通常是雙鏈DNA分子中按對稱軸排列的反向互補序列。星號活力：RE在非標準條件下，能切割一些與其特異識別順序類似的序列，酶的特異性降低，這種現象稱為星號活力，使用時應避免產生星號活力。54.DNA聚合酶.（1）DNA聚合酶 和Klenow片段（2）TaqDNA聚合酶55.Klenow片段的主要用途：補齊雙鏈DNA的3端，使3端標記；在cDNA克隆中，第二股鏈的合成；DNA序列分

18、析56.逆轉錄酶：（多功能酶）功能：（1）依賴RNA的DNA聚合酶活性，以RNA為模版，4種dNTP為底物（此過程稱為逆轉錄作用），催化合成DNA。（2）核酸酶H的水解作用（3）以DNA為模版的DNA聚合酶作用57.末端脫氧核糖核苷酰轉移酶（簡稱末端轉移酶）TdT功能：在載體或目的基因3端上加上互補的多聚體尾，形成便于重組的人工黏性末端用于DNA片段3端的同位素探針標記58.DNA連接酶主要有兩者：大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶輔基分別為 NAD+（只能連接黏性末端）ATP（既能連接黏性末端，又能連接平末端）重組DNA技術中常用T4噬菌體DNA連接酶T4DNA連接酶最初來自受T4

19、噬菌體侵染的大腸桿菌，但目前的分離純化手段已能快速而又簡便的得到大量高度特異性酶。注意：DNA分子磷酸二酯鍵的斷裂稱為切口（Nick），可以用T4 DNA連接酶來修復。DNA分子中核酸缺失，稱缺口（gap），不能單獨用連接酶來修復。59.堿性磷酸酶(1)細菌堿性磷酸酶（BAP）由大腸桿菌分離出來的(2)小牛腸堿性磷酸酶（CIP）由牛腸道分離出來的（兩個催化去除DNA、RNA或dNTP上的5-磷酸基團）主要用途：.除去DNA段上的5磷酸，以防自身連接。.在使用T4多核苷酸激酶和32P同位素標記前，除去RNA或DNA上5端的磷酸，以便進一步用32P標記的r-磷酸重新磷酸化，使5端段被32P標記。6

20、0 核酸酶S1的作用：.除去雙鏈DNA的黏性末端以生產平末端。.除去cDNA合成時形成的發夾結構。 .分析RNA的莖環結構和DNA-RNA分子的雜交情況等。載體主要有質粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。根據其用途分為克隆載體和表達載體61.克隆載體常有兩種：質粒載體和噬菌體載體 1）質粒載體復制特性：緊密型和松弛型（與宿主有關）作為克隆載體的質粒具備特點：具有松弛型復制子；在復制子外存在幾個單一的酶切入點，以便目的DNA插入；具有插入失活的篩選標記，理想的質粒載體應具有兩種抗生素抗性標記；分子量相對較小和較高的拷貝數。質粒缺點：容量較小，一般只能接受小于15kb的外來DNA。

21、質粒克隆載體用途保存和擴增2kb目的DNA 構建cDNA文庫目的DNA的測序作為核酸雜交時的探針來源。目前常用的質粒有PBR322，PUC系列，以及由后者衍生而來的PSP和PGEM系列等。PBR322系列載體特點：帶有一個復制起始點具有二個抗生素抗性基因具有較小的分子量具有較高的拷貝數2）PUC18、PUC19質粒載體2)噬菌體載體：噬菌體載體、M13噬菌體噬菌體是指感染細菌的病毒，按其生活周期分為溶菌性噬菌體和溶源性噬菌體1） 噬菌體包括插入型和置換型兩類，其主要用途：用作一般的克隆載體；用于構建一般的基因體或cDNA文庫（小于22kb）；用于抗體庫或隨機肽庫的構建; 核酸的序列分析。3、表

22、達載體和穿梭載體講的很少，了解它們的結構便可P39-41.62.分子克隆的基本步驟:目的基因的制備載體的選擇和制備目的基因與載體的連接重組DNA導入受體細胞目的基因的篩選和鑒定63.目的基因的獲取制備方法：（1）基因從文庫中獲取【基因文庫（G-文庫）：是指含有某種生物全部基因隨即片段的重組DNA克隆群。（C-文庫）：將細胞的全部mRNA經逆轉錄制備出全套的cDNA克隆群】（2）逆轉錄合成cDNA（3）人工合成DNA片段（100bp）（4）PCR合成（5）直接從染色體DNA中分離目的基因2）載體的選擇：噬菌體和黏性質粒載體常用來構建基因組文庫，pUC系列常用于構建cDNA文庫和克隆較小DNA片段

23、，M13噬菌體則用于克隆一些待測的DNA序列3）目的基因和載體的連接：平末端連接和黏性末端連接（容易些） 黏性末端DNA分子連接（目的基因或DNA插入片段與適當的載體存在同源粘性末端）：用牛小腸堿性磷酸酶去除載體的5磷酸抑制DNA的自身環化，使它只能與未經堿性磷酸酶處理的外源DNA片段連接 平末端連接法（質粒與目的基因無相同的酶切位點）有以下幾種方法T4DNA連接酶連接人工頭連接通過同聚尾連接4）將重組DNA導入受體細胞 （1）重組DNA分子導入原核細胞 目的基因與載體在體外連接成重組體后，需先導入受體細胞，常用的受體細胞是大腸桿菌。轉化方法：Cacl2處理法電擊法轉化作用 ：將重組的DNA分

24、子引入細菌（原核細胞），使其在細菌體內擴增及表達的過程稱為轉化作用轉染：將噬菌體、病毒或以它們為載體構建的DNA重組體導入真核細胞的過程（2）重組DNA分子導入真核細胞Cacl2處理法電擊法聚聚乙二醇介導的轉染法磷酸鈣-DNA共沉淀法二乙胺乙基-葡聚糖介導的轉染原生質體融合脂質體法細胞核的顯微注射法l 5）重組體的篩選和鑒定（）根據載體的性狀變化進行篩選：篩選出轉化菌，篩選帶重組體的克隆，對重組體進行鑒別。根據載體的性狀變化進行篩選根據載體抗藥性標志插入失活選擇-半乳糖苷酶系統根據插入的外源性DNA片段的性狀進行篩選（2）根據重組DNA的結構特征進行篩選重組子大小鑒別篩選 限制性內切酶圖譜進行

25、分析 PCR擴增方法進行鑒定 核酸分子雜交方法進行鑒定 DNA序列分析鑒定64.插入失活效應：選用含有兩個以上的抗藥基因的載體，外源DNA片段插入其中一個基因，并導致這個基因的失活，就可用兩個含不同藥物的平板，互相對照，篩選含重組DNA的菌落65.核酸分子雜交基本原理：利用核酸變性和復性的性質，使具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下按照堿基互補配對原則形成異質雙鏈的過程。（可發生在同源或異源的DNA鏈與DNA鏈之間，也可在RNA鏈與DNA鏈）66.核酸變性（denaturation）：指維系核酸雙鏈互補堿基對之間的氫鏈斷裂變成單鏈的過程，并不涉及共價鍵的斷裂。（黏度減小，浮力密度增大，26

26、0nm處紫外吸收增加，活性降低）（熱變形，酸堿變性，化學變性）67.Tm（melting temperature）：通常把熱變性過程中DNA變性一半所需要的溫度成為融解溫度。DNA的Tm值在8295之間 Tm影響因素：DNA的均一性堿基組成溶液的離子強度pH變性劑68.DNA復性（renaturation）：當變性條件緩慢去除后，兩條彼此分開的互補單鏈重新締合成雙螺旋結構的過程。（許多理化性質恢復，但熱變性后驟然冷卻，DNA則不可復性）退火（annealing）：熱變性后，將溫度緩慢降低而使DNA逐漸冷卻即可復性的過程。復性過程分兩步：成核作用（nucleation）和拉鏈作用（zipperi

27、ng）成核作用：兩條核酸單鏈隨機碰撞形成暫時局部雙鏈，如果局部雙鏈周圍堿基不能配對，則迅速解離，重新碰撞直到找到正確的互補序列，這個過程稱為成核作用。拉鏈作用：在成核的基礎上，兩條單鏈的其余部分堿基迅速互補配對，就像拉鏈那樣形成完整的雙鏈分子。復性速度用Cot1/2衡量，Co：單鏈DNA的起始濃度（mol/L），t為時間（s），Cot1/2表示單鏈DNA的起始濃度與復性一半所需時間之積，與復性速度成反比，與DNA復雜度有關影響因素：DNA的分子大小和復雜度，離子強度，DNA的濃度，溫度69.探針（probe）：廣義上指的是能特異性與特定靶分子發生相互作用，并能被某些方法所檢測的分子。70理想探

28、針的特點：高度特異性易于標記和檢測靈敏度高穩定且制備方便71核酸探針：指能與特定靶基因序列發生特異性互補結合，并可用特殊方法檢測的被標記的已知核酸序列72.核酸探針的種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針1）基因組DNA探針：制備方法：a.分子克隆 b.采用聚合酶鏈反應擴增特定的基因組DNA片段 優點：制備方法簡便、省時、易得，穩定不易降解，標記方法多樣也較成熟2）cDNA探針：cDNA（complementary DNA）：指與mRNA互補的DNA分子，它是以mRNA為模板，遵循堿基互補配對原則，由逆轉錄酶催化合成 優點：具有基因組DNA優點，且不存在內含子和其他高度

29、重復序列，尤其適用于基因表達研究（但制備困難）3）RNA探針：雜交效率高，雜交分子穩定，不存在高度重復序列，非特異性雜交較少，不易標記，易降解4）寡核苷酸探針：特點：a.根據實驗需要合成 b.長度一般為2050nt c.可以識別靶分子的單個堿基變化 d.特異性不高，雜交信號不強 設計原則：a.探針長度一般2050nt b.剪輯成分，Gtc含量在40%60%為宜 c.不應存在大于4bp的互補序列 d.避免同一堿基重復出現多于4次 e.同源性不應超過70%或有連續8個上堿基同源73核酸探針的標記，兩大類（1）放射性核素：最常用，靈敏度和特異性極高，但半衰期短，檢測時間長，污染環境（2）非放射性核素

30、：穩定、安全、經濟、檢測時間短，但靈敏度74.理想探針標記物特點： 高靈敏度 標記物與探針結合后，不影響堿基對的特異性，雜交體的穩定性及其Tm值。檢測方法應高靈敏度、特異、假陽性率低 標記物與探針結合后穩定，保存時間長 標記物對環境無污染、對人體無損傷、價格低廉。75 放射性核素的標記物類型 常用32P 35S 3H 125I 131I其類型特點： 32P:比放射活性 3.4×1014Bq/mmol.最常用。放射性強，釋放的粒子能量高，穿透能力強，靈敏度高，半衰期僅14.4d，射線散射嚴重而影像分辨率，影響結果分析。 35S：比放射活性5.55×1013Bq/mmol.釋放

31、的粒子較32P稍低，半衰期87.1d，靈敏度比32P低，散射作用弱，分辨率較高，適用于原位雜交。3H：比放射活性1.07×1012Bq/mmol，釋放的粒子能量較低，半衰期12.1年，采用延長曝光時間的方法可產生本底低，分辨率高的結果，金庸與細胞原位雜交，可反復使用，對環境影響大。125I、131I：釋放粒子和射線，具有較高敏感性，較強分辨率，危害性大。76放射性核素的標記標記法：采用體外標記法，包括化學法和酶法 1)化學法：利用標記物分子和探針分子上活性基團間的化學反應，將標記物結合到探針分子的標記方法。 2)酶法：預先將標記物標記在核苷酸分子上，經過酶促反應將標記號的核苷酸分子或

32、標記基因摻入或交換到探針分子中的方法，有切口平移法，隨機引物法，末端標記法，PCR標記法，體外轉錄法（1）切口平移法：DNaseI Mg2+ 隨機切割 3OH加d NTP(被標記) E.coliDNA聚合酶I全酶切除5端的核苷酸 合成互補單鏈，適用于任何形式的雙鏈DNA但不適合單鏈DNA和RNA（2）隨機引物法：隨機引物是人工合成的由6個核苷酸殘基構成的寡核苷酸片斷的混合物。模版DNA變性，加入隨機引物在Klenow酶催化加入d NTPs(一種被標記)，變性形成標記探針，適合單雙鏈DNA和RNA探針標記3)末端標記法：3端標記法：模版DNA經限制性內切酶形成5端突出的DNA，klenow酶+d

33、 NTPs變性得到3端標記DNA，經變性成3端標記單鏈DNA探針 5端標記法; T4噬菌體多核苷酸激酶（PNK）標記法、堿性磷性磷酸酶（ALP）切除5端的磷酸基團 PNK作用轉移77.非放射性核素標記：生物素、地高辛、光敏生物素、熒光素、酶標法ALP 和辣根過氧化酶（HRP）核酸探針的純化：乙醇沉淀法凝膠過濾色譜法核酸探針的檢測：（1）放射性：放射自顯影 液體閃爍計數法（2） 非放射性： 偶聯反應、顯色反應（酶促顯色法、熒光法、化學發光法）78.核酸分子雜交的類型：固相雜交和液相雜交兩大類 1）液相雜交：將待測核酸樣品和核酸探針同時放入雜交液中進行反應，然后分離雜交分子和過量的未雜交探針，再對

34、雜交結果進行檢測 固相雜交：預先將待測的靶核酸鏈固定在固相支持物上，然后與溶解于雜交液中的核酸探針進行雜交反應，洗去支持物上未參加反應的游離核酸探針，再檢測雜交信號，分析結果。2）常用固相雜交：Southern 印跡雜交 Northern印跡雜交、菌落原位雜交、斑點雜交、狹縫雜交、原位雜交Southern 印跡雜交:指經凝膠電泳分離的待測DNA片斷轉印并結合到一定固相支持物(尼龍膜或硝酸纖維素膜)，然后用標記的探針DNA分子檢測靶DNA的一種方法。基本過程：限制性核酸內切酶消化待測DNA瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷DNA變性并轉印到固相支持物上預雜交與特異DNA探針雜交雜交信號檢測及結果分析（

35、轉膜方法有毛細管轉移、電轉移、真空轉移）Northern印記雜交：指待測RNA（主要是mRNA）從凝膠轉印到固相支持物上，與標化的DNA探針進行雜交的印跡技術。與Southern印跡雜交不同點：a . RNA易被環境中存在的RNA酶降解，應避免RNA酶污染 b. RNA需要在變性劑（甲醛、乙二醛、甲基氫氧化汞）存在下進行電泳，保持其單鏈狀態，防止RNA分子形成二級結構，不能用堿變性 c. 印跡前將含有變性劑的凝膠用水浸泡除去。79. 聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction,PCR）技術是指生物技術領域中最重要的四項技術之一（細胞融合技術，分子克隆技術，蛋白工程技術，基

36、因擴增技術）特異，敏感，高效，簡便，重復性，移易化等優點。80.PCR的原理：模擬體內DNA半保留復制過程，通過變性，退火，延伸，三步反應的循環完成，靶基因的雙鏈DNA通過變性解鏈為單鏈，特異的引物通過退火與單鏈DNA模版結合，在靶DNA的指導下引物的3端延伸靶DNA的互補鏈完成一個循環，理論上每次循環結束后靶DNA擴增一倍，即靶DNA數目以2 幾何級數方法。（1）反應體系：模版DNA，四種dNTP，引物，TaqDNA聚合酶、緩沖液（含Mg2+）（2）變性（denaturation）:模版DNA經加熱至95左右一定時間后，使模版DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈。退火（

37、annealling）:將下降至適宜溫度（一般較Tm低5）引物與變性的DNA單鏈在堿基互補的基礎上形成引物，模版雜交雙鏈。延伸（exension）:將溫度上升至在70左右時，TapDNA聚合酶催化以引物為起點的從53端DNA鏈延伸反應，隨著4種dNTP的摻入，合成新的DNA互補鏈。（3）動力學：y=A(1+R) 估算PCR產量，A為起始模板量，R為擴增效率，有平臺期81常見問題原因分析和處理（1）假陽性。靶DNA和非靶DNA的污染 （2）假陰性標本處理的原因PCR試劑問題PCR擴增儀故障或擴增過程中的其他PCR產物鑒定的問題（3）引物二聚體兩引物分子間有較多的堿基配對，特別是引物3端有互補區引

38、物模版比例太高，可增加模版用量退火溫度過低循環次數過多（4）非特異性PCR產物（5）PCR污染與預防（6）RNA酶的污染與預防去除外源RNase污染抑制內源性RNase的活性82.擴增產物的檢測與分析（1）凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳。（2）PCR產物的酶切技術：PCR限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）（3）PCR單鏈構象多態性分析PCR-SSCP（4）核酸探針雜交分析點雜交反向點雜交微孔板雜交RNA探針雜交酶免疫分析Southern 印跡雜交（5）PCR-酶聯免疫吸附法（6）PCR產物測序（雙脫氧核苷酸鏈末端終止法、化學裂解法）83.PCR衍生技術：巢式PCR，逆轉

39、錄PCR，多重PCR，錨定PCR，反向PCR，免疫PCR，原位PCR，定量（QPCR）巢式PCR是一種變異的聚合酶鏈反應(PCR)，使用兩對（而非一對）PCR引物擴增完整的片段。第一對PCR引物擴增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為巢式引物（因為他們在第一次PCR擴增片段的內部）結合在第一次PCR產物內部，使得第二次PCR擴增片段短于第一次擴增。巢式PCR的好處在于，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，巢式PCR的擴增非常特異。84.熒光定量PCR技術：1）基本原理：基于熒光能量傳遞技術，通過對PCR擴增反應每個循環結束時產物熒光信號的檢測

40、，對起始模版進行定量分析。85.實時熒光定量PCR（real time FQ-PCR）：在熒光定量PCR反應中，引物的熒光化學物質，在每經過一個循環后，產生一個熒光強度信號，利用熒光信號累積及熒光強度變化實現對整個PCR過程實現監測。熒光閾值:設定在熒光擴增曲線上處于熒光信號指數擴增階段是的任意一個值，一般熒光閾值設置在3-15個循環內Ct值：每個反應管內的熒光信號達到設定的閾值時所經歷的循環數，與模板的起始拷貝數的對數存在線性關系86.熒光定量PCR技術：熒光染料法(常用染料：SYBBGreenI)和熒光探針法 探針法：TaqMan技術，LightCycler探針技術，分子信標技術，復合探針

41、法TaqMan技術:3端的熒光Q分子吸收5端熒光R分子的熒光信號/探針5端連接的熒光R分子被Taq酶切割下來/熒光R分子發出熒光，切割的熒光分子數與PCR數量成比例LightCycler探針技術：有R發光探針和Q淬滅探針 熒光淬滅的程度與起始模版數的量成正比分子信標技術：分子燈塔形成莖環發夾結構，使熒光劑和淬滅劑緊密接觸，導致熒光淬滅/單鏈寡核苷酸探針由于與靶基因堿基序列互補而與之雜交/探針5端和3端分離，淬滅劑對熒光劑的淬滅作用消失，產生熒光復合探針法：有R發光探針和Q淬滅探針 當PCR擴增溶液無模版時，兩探針特異性結合，無熒光；有模版，熒光探針與模版結合，兩探針分離，有熒光87.實驗區分為

42、四個獨立的工作區域：試劑貯存和準備區，標本制備區，擴增區，擴增產物分析區四個基本原則：1.四個區域必須是相互獨立的，2.各區的儀器設備及物品必須是專用的，3.各區不能直通，應設有緩沖間，4.產物分析區產安裝排風扇或其他抽風裝置十六字口訣：各區獨立，注意風向，因地制宜，方便工作。還應設立臨床標本接收區88.室內質量控制（IQC）包括測定前的質量控制，統計學質量控制，質量控制的評價等89DNA序列測定：即DNA一級結構的測定，指用人工的方法測定并分析核酸的堿基組成及排列順序。它是研究基因結構，功能及其關系的前提，是臨床疾病的分子診斷最為精確的判定依據四種常用方法：Sanger雙脫氧鏈末端終止法，M

43、anxam-Glibert化學降解法，焦磷酸測序技術，雜交測序法（1）Sanger雙脫氧鏈末端終止法原理：利用DNA聚合酶，以單或雙鏈DNA為模版以d NTPs（一種被標記）為底物，在四組互相獨立的反應體系中分別加入不同的2,3-雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）作為鏈反應終止劑，根據堿基配對原則，在測序引物引導下，合成四組有序列梯度的互補DNA鏈，然后通過高分辨率的變性聚丙稀酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影檢測后識度待測DNA的互補序列（2）Manxam-Glibert化學降解法原理：首先對待測單或雙鏈DNA作末端（5端或3端）放射性標記，標記后的DNA分四組，分別用不同的化學試劑對不同的堿基進行特

44、異性的化學切割，通過控制化學反應條件，使堿基斷裂只隨機發生在某一個特定的位點，由此各組均產生不同長度的DNA片段，通過（同上）90.自動化測序與傳統方法比較1標化物不同： 熒光染料（自動） 放射性核素（傳統） 2監測手段不同： 掃描儀/PCR循環測序反應方法/集束話的毛細管電泳 放射自顯影/酶反應方法/凝膠電泳 特點：簡便，快速，結果準確可靠，安全無污染，測序能力增強91、生物芯片技術：指通過微加工和微電子技術，在固相基質表面集成了成千上萬密集排列的分子微陣列，以實現對組織、細胞、核酸、蛋白質及其他生物分子進行高效、準確、高通量檢測（微陣列芯片、微流體芯片） 常用：基因芯片、蛋白質芯片、組織芯

45、片、液相芯片、縮微芯片實驗室等。92、基因芯片（Gene Chip）：又稱DNA芯片，DNA微陣列；將大量的基因片段有序的、高密度的固定排列在載體上制成點陣，稱之為芯片。其原理：經過標記的待測樣品DNA通過與芯片上特定位置的探針按堿基配對原理雜交后，經激光聚集熒光檢測系統等對芯片進行掃描，通過檢測雜交信號強度來獲取樣品分子的數量和序列信息，用計算機軟件進行數據比較和分析，從而對基因序列及功能進行大規模、高通量研究。 主要包括四個基本技術環節：芯片微陣列制備、樣品制備及標記、樣品與基因芯片的雜交、信號的檢測及分析。93、蛋白質芯片：指固定于支持節制上的多肽或蛋白質構成的陣列。據用途分：蛋白質功能

46、芯片、蛋白質檢測芯片。據載體分：蛋白質微陣列、微孔板蛋白芯片、三位凝膠塊芯片。還可分：抗體芯片、抗原芯片、肽芯片、小分子芯片、適配體芯片。94、組織芯片：也稱組織微陣列（TMA），將成百上千個不同組織標本按預先設計的順序排列固定在一張載玻片上所成的微陣列。95、液相芯片：又稱懸浮陣列，流式熒光技術，是基于XMAP技術的新型生物芯片技術平臺。其核心技術是把微小的聚苯乙烯微球用熒光染色的方法進行編碼，然后將每種顏色的熒光編碼微球共價交聯上針對特定檢測物的寡核苷酸或蛋白質探針。 優點：僅需少量樣本即可同時定性、定量檢測同一樣本中的多種不同目的分子最突出優點高通量、高效率靈敏度高線性范圍寬重復性好操作

47、簡單靈活性好96、縮微芯片實驗室：又稱微型生物全分析系統（TAS）把生物和化學等領域所（波or譜：不認識）及的樣品制備，生物化學反應和檢測分析的整個過程集成化，并縮微到一張芯片上自動完成，形成所謂的微型全分析系統。97、分子診斷法：（目的物：病原微生物的DNA或RNA） 對病原體特異性核酸序列的雜交，對病原體基因序列的限制性內切酶酶譜分析，限制性片段長度多態性連鎖分析，對病原體基因保守序列的擴增檢測基因芯片技術，支鏈DNA技術依賴核酸序列的擴增，連接酶鏈式反應等。乙型肝炎病毒：PCR 臨床意義：HBV感染的早期診斷，監測治療效果，判斷病情，指導制訂合理的治療方案。結核分枝桿菌TB： TB DN

48、A檢測可采用PCR，FQPCR，競爭性PCR，免疫雜交PCR等，PCRSSCP血紅蛋白病兩類：由于珠蛋白一級結構的變化所導致的異常血紅蛋白病；由于珠蛋白多肽鏈的組成比例改變和珠蛋白含量降低所導致的地中海貧血鐮狀細胞貧血：珠蛋白基因中第六位密碼子的序列由原來的GAC改變為GTG，使對應的氨基酸由原來的谷氨酸纈氨酸 用RE酶切法診斷地中海貧血：分為地貧，地貧，地貧，地貧，地貧，地貧等（一）核酸的分離純化與鑒定：1、核酸分離制備總原則：保證核酸一級結構的完整性 盡量排除其他的污染，保證核酸的純度核酸提純的主要步驟細胞裂解抽提分離核酸純化核酸鑒定2、完整性鑒定：可采用凝膠電泳法，DNA看是否拖尾，RN

49、A為2:1的關系3、核酸的保存：雙蒸水及TE緩沖液儲存DNA，醋酸鈉溶液或三蒸水、RNA酶儲存RNA4、抑制劑：抑制DNase：A、檸檬酸、EDTA等金屬螯合劑 B、加去污劑SDS C、加蛋白變性劑 抑制RNase：A、高溫高壓滅菌或用DEPC處理 B、加強的蛋白變性劑 C、加核糖核酸酶阻抑蛋白真核細胞的破碎方法有超聲波破碎法、勻漿法、液氮破碎法、低滲等物理法和蛋白酶K和去污劑溫和處理法DNA分離純化的方法：酚提取法、甲酰胺解聚法、玻棒纏繞法5、技術路線的設計：（1）核酸的釋放 目的：裂解細胞、釋放核酸 物理方法：物理干燥法、凍融法、滲透壓調節法 化學法：酶解法 （2）核酸分離純化：除去非核酸

50、類大分子污染物 不需要的核酸 溶劑等 （3）核酸的濃縮沉淀洗滌：多價陽離子沉淀，70%-75%乙醇洗滌 （4）核酸的鑒定：紫外分光光度法檢測核酸的濃度及純度（>0.25ug/ml） 熒光分光光度法：溴化乙錠染料6、酚抽提法制備哺乳動物細胞DNA （前處理粗分離精分離）1）、EDTA、SDS等存在下用蛋白質酶K消化細胞 2）酚-氯仿抽提含核酸的水溶液，除蛋白質3）氯仿抽提，取水相7、質粒提取方法：堿裂解法、煮沸裂解、SDS裂解、CsCl8、蛋白酶K-酚抽提法：（DNA）勻漿組織（SDS、蛋白酶K、EDTA）酚氯仿抽提 水相/有機相取上層水相乙醇沉淀重溶解DNA9、異硫氰酸胍-酚-三氯甲烷一步法：（RNA） 勻漿組織苯酚-氯仿抽提離心后取上層水相乙醇沉淀DEPC水重新溶解RNA（4C/細胞裂解液、異硫氰酸胍、硫基乙醇、SDS） mRNA提取：Oligo(dt)-柱層析法實驗區分為四個獨立的工作區域：試劑貯存和準備區，標本制備區，擴增區，擴增產物分析區HGP圖譜：包括序列圖譜、遺傳圖譜、物理圖譜、轉錄圖譜等的繪制如何提高PCR擴增的特異性？ 升高退火溫度可增加引物與模板結合的特異性； 縮短退火和延伸時間，可減少錯誤引發及多余的DNA聚合酶分子參與酶促延伸的機會；降低引物和酶的濃度也