1、1KRAS和和EGFR檢測與臨床應用檢測與臨床應用2匯報內容匯報內容KRAS和和EGFR的簡介及臨床意義的簡介及臨床意義ARMS-PCR的基本原理和技術特點的基本原理和技術特點等位特異性引物設計等位特異性引物設計KRAS試劑盒開發簡介試劑盒開發簡介3KRAS和和EGFR的簡介及臨床意義的簡介及臨床意義4KRAS背景背景KRAS是一種原癌基因，長約是一種原癌基因，長約35kb，位于，位于12號染色體，是號染色體，是RAS基因基因家族成員之一，編碼的蛋白主要參與家族成員之一，編碼的蛋白主要參與PI3K、PTEN、AKT和和RAF、MEK、ERK信號通路的調控；信號通路的調控；EGFR在通路中位于在

2、通路中位于KRAS上游，配體與之結合后可以激發其酪氨酸上游，配體與之結合后可以激發其酪氨酸激酶活性，導致激酶活性，導致KRAS的活化和通路中信號傳導；的活化和通路中信號傳導；KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（是許多惡性腫瘤的常見突變基因：胰腺癌（65%-90%）、結直）、結直腸癌（腸癌（40%）、肺癌（）、肺癌（20%）、卵巢癌（）、卵巢癌（15%）。）。5KRAS基因突變影響結直腸癌藥物療效基因突變影響結直腸癌藥物療效KRAS基因野生型的轉移性結直腸癌患者能從基因野生型的轉移性結直腸癌患者能從EGF抗體（抗體（西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗、帕尼單抗）治療中獲益，而基因突變的患者

3、治療效果很差；）治療中獲益，而基因突變的患者治療效果很差；KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應答，其總體生存期明顯低于突變型患者對西妥昔單抗無應答，其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者野生型患者Karapetis CS, 2008, N Eng J Med6結直腸癌患者檢測結直腸癌患者檢測KRAS突變相關指南突變相關指南歐洲藥品評估局（歐洲藥品評估局（EMEA，2008）指出：）指出：KRAS野生型的進展期結直腸癌患者可能從野生型的進展期結直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。帕尼單抗中受益，而突變型患者受益較少。美國臨床腫瘤學會（美國臨床腫瘤學會（ASCO，2009）推薦：）

4、推薦：轉移性結直腸癌患者應檢測轉移性結直腸癌患者應檢測KRAS突變，突變，如有如有KRAS12、13位突變，則不應進行位突變，則不應進行EGFR單克隆抗體治療；單克隆抗體治療；美國美國FDA指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉移性結腸直腸癌前指南推薦：在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉移性結腸直腸癌前必須檢測必須檢測KRAS基因的基因型；基因的基因型；2012年年7月月6日批準第一個用于結直腸癌的基因檢測（日批準第一個用于結直腸癌的基因檢測（Qiagen），以判斷西妥昔單抗是否有效；，以判斷西妥昔單抗是否有效；美國國立綜合癌癥網絡（美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2014）

5、指南說：）指南說：轉移性結直腸癌患者均應進行轉移性結直腸癌患者均應進行RAS突變檢測（突變檢測（KRAS和和NRAS），至少應檢測），至少應檢測KRAS第二外顯子的突變情況第二外顯子的突變情況。KRAS或或NRAS突變型的病人不應采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。突變型的病人不應采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療。中國衛生部于中國衛生部于2010年年10月月14日發表了結直腸癌診療規范（日發表了結直腸癌診療規范（2010版）版） 。明確指出。明確指出在患者確定為復發或轉移性結直腸癌接受在患者確定為復發或轉移性結直腸癌接受西妥昔單抗西妥昔單抗、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組、帕尼單抗時，必須檢測腫瘤組織的織的

6、K-ras基因狀態。在晚期基因狀態。在晚期/轉移性結直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤轉移性結直腸癌化療中，在治療前檢測腫瘤 K-ras 基因基因狀態，狀態，EGFR不推薦作為常規檢查項目。不推薦作為常規檢查項目。7KRAS基因突變影響非小細胞肺癌基因突變影響非小細胞肺癌藥物療效藥物療效KRAS基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑（TKI，如，如吉吉非替尼、厄洛替尼非替尼、厄洛替尼）治療中獲益，而基因突變的患者易發生抵抗；）治療中獲益，而基因突變的患者易發生抵抗； KRASKRAS突變型患者使用厄洛替尼聯合化療后，其無癥狀生

7、存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中突變型患者使用厄洛替尼聯合化療后，其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者（圖中紅線所示）紅線所示）Anderson SM, 2011, Expert Rev. Mol. Diagn Eberhard DA, 2005, J Clin Oncol 8非小細胞肺癌患者檢測非小細胞肺癌患者檢測KRAS突變突變相關指南相關指南美國國立綜合癌癥網絡（美國國立綜合癌癥網絡（NCCN，2009）指出，）指出，KRAS突變與非小細突變與非小細胞肺癌患者胞肺癌患者TKI抵抗有關，抵抗有關，KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療。治

8、療。當當KRAS基因發生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進基因發生了突變，則不建議病人使用厄洛替尼進行分子靶向治療。行分子靶向治療。9KRAS主要突變位點主要突變位點在結直腸癌中，在結直腸癌中，KRAS突變主要發生于突變主要發生于codon12 (80%)、codon13 (15-20%)、codon61和和146 (C6239G719S182155GA6252G719C182155GT6253E746-A750del(1)192235-2249del156223E746-A750del(2)192236-2250del156225L747-P753S192240-2257del1812370

9、E746-A750I192235-2252AAT(complex)13551E746-A750del192235-2253del1812728E746-A750A192237-2251 del1512678E746-S752A192237-2254 del1812367E746-S752V192237-2250 T(complex)12384E746-S752D192238-2255 del186220L747-A750P192238-2248 GC(complex)12422L747-T751Q192238-2252 GCA(complex)12419L747-E749del192239-2

10、247del96218L747-T751del192239-2253del156254L747-S752del192239-2256del186255L747-A750P192239-2248TTAAGAGAAG C12382L747-P753Q192239-2258CA(complex)12387L747-T751S192240-2251del126210L747-T751del192240-2254del1512369L747-T751P192239-2251 C(complex)12383T790M202369C T6240S768I202303GT6241V769-D770insASV

11、202307-2308 ins GCCAGCGTG12376H773-V774insH202319-2320 ins CAC12377D770-N771insG202310-2311 ins GGT12378L858R212573TG6224L861Q212582TA621315EGFR突變與突變與EGFR-TKI藥物療效關藥物療效關系系所在外顯子所在外顯子突變類型突變類型與與EGFR-TKI療效關系療效關系18G719A(S/C)3種點突變種點突變藥敏突變藥敏突變1919種缺失突變種缺失突變藥敏突變藥敏突變20點突變點突變S768I藥敏突變藥敏突變20點突變點突變T790M耐藥突變耐藥突變*

12、203種插入突變種插入突變耐藥突變耐藥突變*21點突變點突變L858R藥敏突變藥敏突變21點突變點突變L861Q藥敏突變藥敏突變16ADx EGFR試劑盒突變結果檢測試劑盒突變結果檢測組別組別突變類型突變類型所占比例所占比例對吉非替尼對吉非替尼敏感性敏感性證據證據 1Exon 19 deletions; L858R 90%充分充分2T790M/deletion; T790M/L858R; G719X; L861Q; S768I 7%有限有限3T790M alone; Exon 20 insertions; other mutations 3%無無17ARMS-PCR的基本原理和技術特點的基本原

13、理和技術特點18ARMS-PCR原理原理ARMS是是Amplification Refractory Mutation System (擴增阻礙突擴增阻礙突變系統變系統)的縮寫。的縮寫。根據根據 PCR過程中要求引物和模板間的嚴格互補配對來實現對突變位過程中要求引物和模板間的嚴格互補配對來實現對突變位點的檢測點的檢測, 當引物當引物 3 末端出現錯配時末端出現錯配時, 產物將不能延伸。產物將不能延伸。因此設計兩條上游（或下游）引物，因此設計兩條上游（或下游）引物，使其使其3末端分別與突變位點堿基末端分別與突變位點堿基匹配和錯配匹配和錯配，共用下游（或上游）引物，分別擴增野生型和突變型目，共用下

14、游（或上游）引物，分別擴增野生型和突變型目的片斷。的片斷。19ARMS-PCR原理原理Two Allele-Specific (AS) primers, one for each allele of a SNP are designed. The AS primers contain one of two polymorphic nucleotides at the primer 3 end. Two sets of primers, either forward or reverse primers can be designed. If a common reverse or forwar

15、d primer is used in a PCR reaction, the reaction is called allele-specific PCR (AS-PCR). You F. M. 2008, BMC Bioinformatics20PCR產物檢測產物檢測-Real time PCR每個每個PCR循環循環檢測熒光信號檢測熒光信號，不同不同PCR產物，不同熒光信號產物，不同熒光信號相比凝膠電泳：更快，可定量，無相比凝膠電泳：更快，可定量，無PCR產物污染產物污染信號產生方法：信號產生方法：Scorpion (Qiagen)，雙環探針，雙環探針(廈門艾德廈門艾德)，Taqman，M

16、olecular beacons，Sybr green，Yo-proFigure 2 The sensitivity of QuanTAS-PCR for quantifying JAK2 mutant alleles.Zapparoli G. V. 2013, BMC Cancer21應用于應用于Real time-PCR的的ARMS-PCRGCATGAAGG alleleA allele55553333AS primerAS primerMismatchMismatchReverse primerReverse primerFAM-53-BHQ1FAM-53-BHQ1ProbeProbe2

17、2ARMS技術特點技術特點優點：優點：靈敏度高靈敏度高（0.1-1%）操作簡便操作簡便周期短周期短不產生不產生PCR產物污染產物污染適用樣本類型多適用樣本類型多（如（如FFPE）精確突變類型精確突變類型缺點：缺點：方法建立需時較長方法建立需時較長僅能檢測已知突變僅能檢測已知突變23測序法與測序法與ARMS法相比較法相比較Sanger測序法測序法焦磷酸測序焦磷酸測序ARMS敏感度敏感度10-20%5-10%1%FFPE標本成功率標本成功率 低低較高較高高高商用試劑盒商用試劑盒無無有有有有流程與速度流程與速度1-2天天2-3天天AGTGly13SerGGCAGCGly12ArgGGTCGTGly1

18、3ArgGGCCGCGly12CysGGTTGTGly13CysGGCTGCGly12AspGGTGATGly13AspGGCGACGly12AlaGGTGCTGly13AlaGGCGCCGly12ValGGTGTTGly13ValGGCGTC30三引物設計原理三引物設計原理You F. M. 2008, BMC Bioinformatics31三引物設計三引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTC

19、CTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 19nt，51突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-319nt，49下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-325nt，5432三引物設計三引物設計下游引物設計下游引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTA

20、ATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列選擇序列： 5-GACGAATATGATCCAACAATAGAGG-3互補鏈：互補鏈：3- CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC-5下游引物：下游引物：5- CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC -3333端增加錯配端增加錯配如果如果3端是弱錯配（端是弱錯配（C/A或或G/T）則需要引入強的錯配（）則需要引入強的錯配（A/G或或

21、C/T）才可阻斷才可阻斷3端的擴增；端的擴增；如果如果3端是強錯配（端是強錯配（A/G或或C/T）則需要引入弱的錯配（）則需要引入弱的錯配（C/A或或G/T）或不需引入錯配即可阻斷或不需引入錯配即可阻斷3端的擴增；端的擴增；當當3端是中度錯配（端是中度錯配（A/A，C/C，G/G 或或T/T）則需要引入中度的錯配）則需要引入中度的錯配。野生型引物（野生型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTG-3 突變型引物（突變型引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCCT-3下游引物（下游引物（R）5-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-334四引物設計四引物設計35四

22、引物設計四引物設計ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG內引物（內引物（F）5-CTTGTGGTAGTTGGAGCTA-3 內引物（內引物（R）5-ACTCTTGCCTACGCCACC-3外引物（外引物（F）5-ATGACTGAATATAAACT-3外引物（外引物（

23、R）5-CTCTTGACCTGCTGTGTCG-336KRAS試劑盒開發簡介試劑盒開發簡介37KRAS突變探針和引物設計突變探針和引物設計KRAS序列：序列：ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG1. 5-CTT GTG GTA GTT GGA GCT TA-3 1

24、2GGT GAT 2. 5- AAA CTT GTG GTA GTT GGA GCG GT-3 12GGT GTT3. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCT GC-3 12GGT GCT4. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCT A-3 12GGT AGT5. 5- AA CTT GTG GTA GTT GGA GCG T-3 12GGT TGT6. 5- ATAAA CTT GTG GTA GTT GGA GCC C-3 12GGT CGT7. 5- GTG GTA GTT GGA GCT GGT AA-3 13GGC GAC8. 參照引物：

25、參照引物：5-CT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT-39. 下游引物：下游引物：5-ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC-3 TaqMan探針：探針：5-FAM-TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-BHQ1-3鎖核酸阻滯探針鎖核酸阻滯探針(野生型野生型)： 5-T GGA GCT GGT GGC GTA GGC-P04-3浙江大學，浙江大學，CN 102367478 B38反應體系反應體系 引物終濃度：引物終濃度：0.3 M Taqman探針終濃度：探針終濃度：0.1 M LNA阻滯探針終濃度：阻滯探針終濃度：0.9 M Goldstarbest Taq酶終濃度：酶終濃度：0.05 U/l 模板模板DNA終濃度：終濃度：10-300 ng/l