1、    腫瘤細胞的甲硫氨酸依賴性對提高腫瘤化療療效的作用         摘要目的探討腫瘤細胞的甲硫氨酸依賴性在提高腫瘤化療療效方面的作用及意義。方法將甲硫氨酸(Met)依賴性腫瘤細胞SGC-7901、MCF-7和非Met依賴性腫瘤細胞A549、A375培養于Met- Hcy+和Met+Hcy-培養基中，加入不同濃度的周期特異性化療藥5-Fu或非周期特異性化療藥MMC；在細胞與藥物接觸不同時間段，用MTT比色法檢測化療藥物的抑瘤率。結果Met- Hcy+中的5-Fu對Met依

2、賴性腫瘤細胞的抑瘤率較Met+ Hcy-中的5-Fu的抑瘤率有顯著性提高；而5-Fu對非Met依賴性腫瘤細胞的抑瘤率，在兩種培養基間差異無顯著性。MMC對Met依賴性、非Met依賴性腫瘤細胞的抑瘤率未因培養基的不同而差異有顯著性。結論利用腫瘤細胞的Met依賴性，Met- Hcy+培養基可顯著提高周期特異性化療藥(5-Fu)對Met依賴性腫瘤細胞的抑瘤率，但不能提高周期非特異性化療藥(MMC)的抑瘤率。關鍵詞甲硫氨酸腫瘤細胞周期特異性化療The implication of tumor cells' methionine dependence in chemotherapyCAO Wei

3、xin, XU Ning, YIN Haoran, et al.Rui Jin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025Abstract Objective To study the implication of tumor cells' methionine (Met) dependence in promoting the effects of chemotherapy.Methods Met-dependent tumor cells (SGC-7901 and MCF-7) and Met-ind

4、ependent tumor cells (A549 and A375) were cultured in Met- Hcy+ and Met+ Hcy- media separately, then cell-cycle specific chemotherapeutic agent (5-Fu) and cell-cycle nonspecific chemotherapeutic agent (MMC) in different concentration gradients were added. The inhibitory rate of tumor cells were test

5、ed by MTT assay after different contacting time between the cells and the agents. Results The combination of 5-Fu with Met- Hcy+ medium made a significantly higher inhibitory rate to Met-dependent tumor cells than the combination of Met+ Hcy- medium with 5-Fu. However, to Met-independent tumor cells

6、, there was no significant difference of inhibitory rate that 5-Fu could make, whether it was combined with Met- Hcy+ or Met+ Hcy- medium. As a cell-cycle nonspecific chemotherapeutic agent, MMC did not make significantly different in inbibitory rate between Met- Hcy+ medium and Met+ Hcy- medium, wh

7、ether to Met-dependent tumor cells or Met-nondependent tumor cells.Conclusion In the light of Met-dependence of tumor cells, Met- Hcy+ medium can significantly increase the inhibitory rate of cell-cycle specific chemotherapeutical agent to Met-dependent tumor cells, but cannot do it when the drug is

8、 cell-cycle nonspecific chemotherapeutical agent.Key words Methionine Tumor cell Cell-cycle specific chemotherapy Cell-cycle nonspecific chemotherapy我們利用四甲基偶氮唑藍(MTT)快速比色法，探討腫瘤細胞在體外培養中的甲硫氨酸(Met)依賴性在腫瘤化療中的意義，現將結果報道如下。材料與方法1.細胞培養(1)細胞株：實驗對象選擇已知具有Met依賴性的MCF-7乳腺腺癌細胞和SGC-7901細胞(人胃腺癌，1979年上海市第六人民醫院建株)，以及非M

9、et依賴性的A569(肺癌)和A375(惡性黑色素瘤)細胞(均購自中國科學院上海細胞研究所細胞庫)。(2)培養條件2：以不含Met的RPMI-1640培養液(GIBCO公司)為基礎，按表1配制成含Hcy、不含Met的Met- Hcy+培養基和含Met、不含Hcy的Met+ Hcy-培養基。各組細胞均培養于37，含體積分數為5%CO2和體積分數為95%空氣的細胞培養箱(NAPC05410，美國)中。表1Met- Hcy+培養基和Met+ Hcy-培養基的補充成分培養基MetHcy葉酸VitB12慶大霉素小牛血清Met- Hcy+-200mol/L100mol/L1.5mol/L0.2g/L20%

10、Met+ Hcy-100mol/L-100mol/L1.5mol/L0.2g/L20%     2.配制化療藥物溶液分別以Met- Hcy+培養基和Met+ Hcy-培養基為基礎配制不同濃度梯度的5-氟脲嘧啶(5-Fu)和絲裂霉素(MMC)藥物溶液。其中，5-Fu溶液的濃度梯度為0、2、20、40、100、200mg/L，MMC溶液的濃度梯度分別為0、0.6、6、60mg/L，均為與細胞接觸的終濃度的2倍。3.MTT測試1，2(1)各組細胞分別以Met- Hcy+和Met+ Hcy-為培養基制成單細胞懸液，調整細胞濃度為2×105/ml。(2)

11、接種：將每種單細胞懸液接種于96孔板中，100l/孔。5-Fu組設0、1、10、20、50、100mg/L共6個濃度組，MMC組設0、0.3、3、30mg/L共4個濃度組，每組設4個復孔，0濃度組為空白對照組。(3)加藥：細胞培養24小時后，加入各濃度梯度5-Fu或MMC藥物溶液，每孔100l，使每孔總液量達到200l。與腫瘤細胞接觸的5-Fu終濃度分別為0、1、10、20、50、100mg/L(10mg/L為體內血峰濃度)；MMC終濃度分別為0、0.3、3、30mg/L(3mg/L為體內血峰濃度)。(4)繼續培養24小時和48小時后，每孔加5mg/L的MTT20l；4小時后，以1500r/m

12、in離心5分鐘，棄上清液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)200l，振蕩，吹打，充分溶解孔底的結晶物。(5)自動酶標儀比色，波長為490nm，得到每孔的光密度值(OD)，每組取4孔的平均OD值。(6)計算化療藥物的抑瘤率：    4.統計學方法方差分析。結果1.5-Fu的抑瘤率與Met+ Hcy-培養基組相比，Met- Hcy+培養基組中的MCF-7、SGC-7901細胞(Met依賴)與5-Fu接觸24小時，抑瘤率差異無顯著性(P0.05)；而接觸48小時后，抑瘤率有顯著提高。非Met依賴的腫瘤細胞(A549、A375)經兩種培養基培養后，無論與5-Fu接觸

13、24小時還是48小時，抑瘤率均無顯著改變。各組細胞的抑瘤率均隨5-Fu濃度的升高而增加。2.MMC的抑瘤率MMC對Met依賴性腫瘤細胞(MCF-7，SGC-7901)或非Met依賴性腫瘤細胞(AM-Hcy+培養基和Met+ Hcy-培養基)或細胞與藥物接觸時間的長短(24小時或48小時)而差異有顯著性(P0.05)。但MMC對各組細胞的抑瘤率均隨著藥物濃度的升高而增加。討論本研究結果顯示，兩種不同培養基加5-Fu溶液的抗腫瘤作用有明顯差異，提示Met- Hcy+培養基具有化療藥物增效劑的作用，但如果5-Fu與細胞接觸時間縮短為24小時，則兩種不同培養基加5-Fu的抑瘤作用差異無顯著性。推測其原因，可能系實驗開始階段，培養基中的小牛血清含有少量Met，隨著培養時間的延長，外源性Met逐漸耗盡，腫瘤細胞對Met的依賴性逐漸顯露。在加入MMC的實驗中，盡管在3mg/L的血峰濃度，MMC對腫瘤細胞有較高的抑制率，然而，無論是Met依賴性還是非Met依賴性腫瘤細胞，MMC的抑瘤率還是非Met依賴性腫瘤細胞，MMC的抑瘤率并未因不同培養基而產生顯著差異；并且，也未因MMC與細胞的接觸時間不同而呈現