1、胎鼠海馬神經細胞的原代培養及鑒定王勇,馬武華,鐘 鳴,王可佳(廣州中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科,廣州510405中圖分類號:R614;R743.31 文獻標識碼:A 文章編號:1006-2084(201207-1088-03摘要:目的 建立較理想的S D 大鼠胎鼠海馬神經細胞體外原代培養方法。方法 孕18d(E18S D 大鼠的胎鼠,采用胰酶消化和機械分離相結合的方法進行海馬神經元的原代無血清培養。結果 在體外培養條件下神經細胞結構特征明顯化,并能形成典型的神經細胞網絡。結論 該培養技術是海馬神經細胞體外培養的理想方法。關鍵詞:胎鼠;海馬神經元;原代培養Primary Cult ure and

2、 Identificat ion of Hippocampal Neuro ns of Fetal Rat Neurons WANG Yong,MA W u-hua,ZHONG Ming,W ANG Ke-jia.(Depar tm ent of Anesthes iology,the Firs t Affliated Hospital of Guang-zhou University of Tr aditional C hines e Medicine,Guangz hou 510405,ChinaAbst rac t:Objective To establish a better pr i

3、mary culture method for the primar y culture for hipocam-pal neur ons of SD fetal ra ts.Met ho ds Trypsin digestion a nd mechanical dissociation wer e a dopted to con-duct monolayer pr imary culture.Res ults Under the culture condition in vitro,fetal rat neurons showed simi-lar for m proper ties to

4、their counter par ts in v ivo and typical nerve fiber net was formed.Conclusion This technique is an ideal tool for culture in vitro for neurons of hippocampal tissue.Key words :Fetal ra t;Hippocampal neurons;Primar y culture海馬是神經元高度集中的部位,具有中樞神經系統的典型特性,在學習、記憶、情緒反應及自主神經功能等方面發揮重要作用。而海馬又是癲癇、缺血/缺氧、神經變性疾

5、病的主要病灶。神經元細胞培養模型是研究神經元發育分化、神經再生、神經疾病的發生機制等重要的實驗模型1。海馬細胞的原代培養方法文獻報道不一,總體可以分為有血清培養和無血清培養兩種。有血清培養,血清可以提供細胞生長所必需的營養成分,可以促進細胞的增生和D NA 的合成,但由于血清成分復雜,對于要求較高的實驗研究結果影響較大。無血清培養步驟簡便,培養的細胞活性及生理特性保持良好,具有較大的優越性。為了研究中藥對海馬神經元發育的影響,本課題組采用無血清培養方法,建立Spra gue-Daw ley(S D大鼠胎鼠的海馬神經元體外培養模型,并對其進行形態學觀察及純度鑒定,獲得了一種簡便可行、易于生長的培

6、養方法。1 材料與方法1.1 材料免疫組化試劑盒(即用型(武漢博士德生物工程有限公司。配置好的50g/m L 多聚賴氨酸溶液800L 加入6孔培養板中,輕輕晃動,使多聚賴氨酸溶液覆蓋培養板或培養瓶底面,置37,5%CO 2培養箱內放置過夜,吸棄多余的多聚賴氨酸溶液,并用PBS 輕輕蕩洗兩次,置培養箱中備用。細胞懸液0.1m L計數。根據計數結果,調整細胞終濃度為2×106個/mL。按5×1057×105個/cm2接種于包被好的培養板中,12h內禁止晃動。酮固定10m in。用PBS液沖洗3遍,3%H2O2(30%雙氧水和純甲醇按19的溶劑比混合封閉內源性過氧化物酶

7、,室溫下10m in。PBS洗3遍, 0.3%Triton破膜(溶解細胞膜、細胞核膜、細胞器膜上的脂質15min,PBS洗3遍。10%羊血清封閉,室溫10min。吸棄血清(不洗。一抗37反應1h (20L NS E+1mL稀釋液;設空白對照,以PBS液代替一抗。PBS洗3×5m in,二抗(羊抗兔室溫下18m in,PBS洗3×5min,SABC復合物37、18min。PBS洗3×5min,DAB顯色(5min。鏡下觀察,自來水終止。DAB稀釋度(150,蘇木素復染(3min。95%乙醇脫水,二甲苯透明20m in,中性樹膠封固。風干,鏡下觀察。2 結果2.1 相

8、差顯微鏡下觀察原代培養大鼠海馬神經元形態學改變海馬神經細胞接種時呈圓球形,相差顯微鏡下觀察可見明顯光暈,一般12h開始貼壁,呈扁平圓形生長,有小的集落生成。12h后大部分細胞均已貼壁,呈圓形,周圍有光暈,少數細胞伸出一至兩個突起(圖1-A。24h后突起一般20 40m,生長狀況良好的細胞透亮勻質,開始鋪展,突起變粗變長,并出現末端分支,同時由于有部分已貼壁的神經元和膠質細胞的死亡,背景出現許多細小的球形體(圖1-A。3d后突起進一步增多并形成稀疏的網狀,胞體逐漸長大,光暈良好,軸突和樹突逐漸延伸,鄰近神經細胞突觸之間形成神經網絡(圖1-C。實驗中選取培養79d的神經細胞,此時細胞呈錐體狀或多極

9、形,胞體豐滿,胞核大,僅見極少胞質,胞質透亮,胞周光暈明顯,立體感強,有很強的折光性,胞體突起較長且較完整,細胞核呈圓形或卵圓形,常偏于胞體一側,內有12個核仁,神經細胞突起相互交織成網狀,神經細胞的純度高,幾乎難以看見多形和梭形的星狀膠質細胞和小膠質細胞(圖1-D。A培養12h(×200B培養24h(×100C培養3d(×200D培養7d(×200圖1 培養的海馬神經元2.2 免疫細胞化學染色鑒定結果普通光學顯微鏡下可見大部分細胞(>90%NS E免疫陽性顆粒位于神經細胞核周質及核突起中(呈棕黃色,細胞核不染色,為一圓形或橢圓形淡然區,此類細胞為神經元(圖2-A;空白對照(以PBS為一抗僅見細胞核呈藍色,胞體及突起均不著色(圖2-B。表明本培養方法可得到純度較高的大鼠海馬神經元細胞。A NS E抗體染色(×400B PBS染色(×400圖2 海馬神經元鑒定3 討論大腦海馬部位的神經元高度集中,是中樞神經系統中最易受缺血/缺氧等因素影響造成損傷的部位之一,并與人體多種生理功能密切相關;海馬神經元細胞培養排除了整體實驗中循環、體液、內分泌及血腦屏障等復雜因素的影響,是研究腦缺血/缺氧相關機制的行之有效的實驗模型。神經組織的分離細胞培養是神經組織體外培養技術的