1、    補腎益智方對老年性癡呆大鼠學習 記憶能力保護作用的觀察         摘要：為尋求防治老年性癡呆的有效措施，運用Morris水迷宮評價了中藥補腎益智方(由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等組成)對由D_半乳糖致亞急性衰老加上Meynert核損毀所致阿爾茨海默病模型大鼠的學習記憶能力的保護作用。結果表明：補腎益智方能夠改善模型大鼠的學習記憶成績，包括縮短模型大鼠在Morris水迷宮中尋找到平臺的逃避潛伏期(P0.01)，延長其在原平臺象限游泳的距離(P0.05)

2、。提示補腎益智方對阿爾茨海默病模型大鼠的學習記憶能力有一定的保護作用。主題詞：癡呆，老年性/中藥療法；阿爾茨海默病/中藥療法；記憶障礙/中藥療法；補腎藥/治療應用；補腎益智方/藥理學；疾病模型，動物；大鼠中分類號：R749.1+6文獻標識碼：A老年性癡呆(又稱阿爾茨海默病，Alzheimer's disease,AD)已成為嚴重危害老年人健康和影響其生活質量的主要疾病之一，但目前仍缺乏有效的防治藥物和方法。為此，我們應用 Morris 水迷宮評價了自制的補腎益智方對由  D_ 半乳糖致亞急性衰老加上鵝膏蕈氨酸(Ibotenic acid,IBO)損毀腦 Meynert 基底核

3、所致的 AD 大鼠模型的學習記憶能力的保護作用。1材料與方法1.1藥物與試劑補腎益智方由蛇床子、枸杞子、女貞子、人參等中藥組成，制成濃縮液。雙益平片購自上海紅旗制藥廠(批號為 970101)，每片含石杉堿甲(Huperzine_A)0.05mg。D_ 半乳糖為上海試劑二廠出產，IBO 購自 Sigma 公司，均為分析純。1.2動物分組、造模與給藥15 月齡初老年雌性 Wistar 大鼠 48 只，體重 300450 g，均由第一軍醫大學實驗動物中心提供。常規分籠飼養，自然照明，隨意飲水和取食。隨機分成 4 組，每組 12 只：其中初老年正常對照組(簡稱正常組)，腹腔注射生理鹽水 6 周及腦內

4、Meynert 核注射生理鹽水；AD 模型組(簡稱模型組)，腹腔注射 D_ 半乳糖(48 mg.kg-1.d-1)6 周和腦內雙側 Meynert 核注射 IBO；雙益平片觀察組(簡稱雙益平組)和補腎益智方觀察組(簡稱補腎方組)，造模均同模型組，但在腹腔注射半乳糖(6 周)同時分別給予雙益平片(0.3 mg.kg-1.d-1)或補腎益智方濃縮液(相當生藥量 6 g.kg-1.d-1)灌胃。腦內注射在腹腔注射后參考有關文獻進行1。造模結束后，正常組、模型組、雙益平片組和補腎方組分別存活 9 只、8 只、7 只和 9 只。1.3Morris 水迷宮及檢測所有大鼠在腦內注射后進行 Morris 水迷

5、宮測試。Morris 水迷宮(Morris water maze,MWM)參照有關文獻制作2。為一不銹鋼的圓形水池，直徑 200 cm，高 50 cm，水深 30 cm，水溫控制在(26±1)。池壁標明 4 個入水點，由此將水池等分為 4 個象限，任選其中 1 個象限，正中放置 1 個直徑 11 cm、高 29 cm 的平臺。迷宮上方安有攝像機，并和錄像機以及顯示器連接，自動錄入大鼠游泳軌跡進行分析。測試程序包括：(1)定位航行試驗(place navigation)：歷時 5 d，每天上下午各 4 次，將大鼠面向池壁分別從 4 個入水點放入水中，記錄其在 2 min 內尋找到平臺的

6、時間(逃避潛伏期，escape latency)。如果大鼠在 2 min 未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，讓大鼠停留 10 s，再放回籠中。(2)空間探索試驗(spatial probe)：第 6 天撤除平臺，將大鼠任選 1 個入水點放入水中，記錄其 2 min 的游泳軌跡，分別計算其跨越各象限內的游泳距離以及在原平臺象限游泳的時間和距離占整個游泳時間和距離的百分比。1.4統計方法采用 SAS6.12 統計軟件包分析。其中單因素方差分析，根據方差齊性檢驗結果，分別采用 Newman_Keuls 法或 Scheffe 法。多因素重復測量方差分析采用 Huynh_feldt 法。顯著性水

7、平取 =0.05。2結果2.1大鼠逃避潛伏期的總體變化 1 是各組大鼠在歷時 5 d 40 次定位航行試驗中日平均逃避潛伏期的變化。從中可以看到，4 組大鼠均隨著訓練天數增加，逃避潛伏期越來越短，表明各組大鼠在歷次學習訓練中均已逐漸學習尋找平臺。但學習記憶過程存有明顯差異。經以測得的大鼠每次逃避潛伏期作為觀察值，以組別、測試天數作為效應因子(effective factor)對各組大鼠的總體逃避潛伏期變化進行多因素重復測量統計分析3，結果表明各組間逃避潛伏期 5 d 的總體變化具有顯著性差異(P0.01)。兩兩比較發現：模型組的逃避潛伏期較正常組明顯延長，差異有顯著性(P0.001)。補腎益智

8、方組分別與模型組、雙益平組比較，其逃避潛伏期顯著縮短(均 P0.001)，但同時其逃避潛伏期仍較正常組顯著延長(P0.001)。雙益平組與模型組比較，差異則無顯著性(P0.05)，與正常組比較有顯著性差異(P0.001)。2.2大鼠空間探索所反映記憶能力的變化表 1 為各組大鼠撤除平臺后 2 min 在各象限游泳的距離(R、P、L、O 分別代表大鼠在原平臺右側象限、原平臺象限、原平臺左側象限和原平臺對側象限)。經單因素方差分析，正常組大鼠各象限游泳距離的差異有顯著性(P0.001)，補腎方組大鼠各象限游泳距離之間的差異亦有顯著意義(P0.05)，而模型組、雙益平組大鼠各象限游泳距離差異無顯著性

9、(P0.05)。表明正常組和補腎方組大鼠對原平臺象限的記憶較模型組和雙益平組好。    1各組大鼠 5 d 逃避潛伏期動態變化組 別N/只各象限游泳距離p1(tP/tT)p2(lP/lT)RPLO正常組9600.00±127.531095.94±260.53410.63±183.48328.13±110.140.53±0.100.45±0.08模型組8502.50±101.73532.50±334.55389.06±107.23450.00±177.390

10、.27±0.10#0.27±0.11#雙益平組7519.64±163.10617.14±225.65502.50±152.11462.54±204.650.29±0.12#0.30±0.11#補腎方組9472.50±211.24668.33±245.83442.50±188.62336.67±188.040.33±0.09#0.40±0.12#與正常組比較 P0.05，# P0.01；組內各象限游泳距離比較 P0.05， P0.01 同時我們檢測了各組大鼠

11、在原平臺象限(P)游泳的時間(tP)和距離(lP)與總游泳時間(tT)和總距離(lT)之比p1(tP/tT)和p2(lP/lT)。經單因素方差分析，上述 4 組之間的時間比和距離比比較，差異均有高度顯著性(P0.01)。兩兩比較結果顯示：模型組、雙益平組原平臺象限游泳的時間比和距離比分別與正常組比較，差異均有顯著性(均 P0.01)，二者之間比較無顯著性差異(均 P0.05)。補腎方組原平臺象限游泳的時間比和距離比分別與模型組和雙益平組比較，差異不顯著(均 P0.05)，但有增加的趨勢。3討論缺乏有效的防治方法是當前 AD 研究中亟待解決的主要問題之一。目前在臨床上已經使用的 AD 治療藥物主

12、要包括膽堿酯酶抑制劑、鈣阻滯劑和神經營養劑等，但療效均不能令人滿意。如美國 FDA(Food and Drug Administration)已批準臨床用于治療 AD 的 Tacrine(他克林)、Aricept(安理申)均僅能改善部分認知障礙的癥狀，且肝臟毒性等副作用較大4，5。發揮中醫特色，尋求治療 AD 的有效中藥有十分重要的意義。國內外已有許多學者就此進行了研究，初步結果提示補腎、調心等方藥對實驗性 AD 模型鼠學習記憶能力有一定的改善作用68。但在既往的研究中常常存在模型不甚理想、學習記憶行為評價不夠科學客觀以及統計分析方法不當等問題。補腎益智方針對 AD 腎精不足、氣血虧虛的病機設

13、計組方，全方具補腎填精、益氣養血、開竅醒神之功效，臨床試用于癡呆已顯示了初步的療效。為進一步明確補腎益智方對 AD 學習記憶的作用，本研究在 AD 動物模型、學習記憶檢測以及統計學分析等方面作了較大的改進。在總結以前 AD 動物模型研究成果的基礎上，設計了 D_ 半乳糖致亞急性衰老合并 Meynert 核損毀的多因素復合實驗性 AD 大鼠模型，即在國內外認可和廣泛使用的 D_ 半乳糖致亞急性衰老模型提供一個老化背景的基礎上，再以 IBO 損毀 Meynert 核模擬 AD 的膽堿能神經功能缺失。我們的前期研究工作已表明，此模型大鼠表現為空間學習記憶能力顯著下降，大腦皮質廣泛區域 AChE 陽性

14、神經纖維密度均較正常對照組顯著減低，提示該復合模型較以前的單因素 AD 動物模型更貼近 AD 復雜的臨床病理變化過程1，9。同時，我們還認為，由于中藥作用的多環節性，復合的 AD 模型可能更適合用作篩選防治 AD 有效中藥的研究。另外，我們選用了近年發展較快、能夠較好地評價實驗動物空間學習記憶能力的 Morris 水迷宮測試系統，應用了包括多因素重復測量數據在內的統計分析方法，提高了研究結果的客觀性和科學性。上述研究結果提示，D_ 半乳糖加速衰老加上 Meynert 核損毀的 AD 模型組大鼠在 Morris 水迷宮中平均逃避潛伏期明顯延長、原平臺象限游泳的時間和距離顯著縮短，表明模型組大鼠學

15、習記憶能力嚴重受損。而補腎方組大鼠逃避潛伏期較模型組和對照組縮短，以及原平臺象限游泳的距離和時間延長。提示補腎益智方對本實驗 AD 模型鼠的學習記憶能力有優于對照藥的保護作用。另一方面，補腎方組大鼠與正常組在 Morris 水迷宮測試中存在的差異，似乎提示補腎益智方尚無法完全保護 D_ 半乳糖和 IBO 所致的大鼠空間學習記憶損害，這可能與模型組神經元損毀的程度較重、神經元修復能力 的極限以及補腎益智方作用的強度、給藥劑量和作用機制有關。本研究顯示了補腎益智方對 D_ 半乳糖和 IBO 所致 AD 模型大鼠空間學習認知損害的初步保護作用，對其作用的神經生物學基礎尚有賴于今后進一步研究和探討。基

16、金項目：國家“九五”科技重點攻關課題，編號：96-906-09-02作者簡介：第一作者，賴世隆男，1940 年出生，教授，博士生導師；賴世隆（廣州中醫藥大學老年腦病研究所，廣州510405）胡鏡清（廣州中醫藥大學老年腦病研究所，廣州510405）王奇（廣州中醫藥大學老年腦病研究所，廣州510405）溫澤淮（廣州中醫藥大學老年腦病研究所，廣州510405）梁偉雄（廣州中醫藥大學老年腦病研究所，廣州510405）參考文獻：1胡鏡清，賴世隆，王奇，等.補腎益智方對阿爾茨海默病大鼠模型腦內膽堿能神經系統的保護作用J.廣州中醫藥大學學報，1999，16(3)：2012Morris R.Developme

17、nt of a water_maze procedure for studying spatial learning in the ratJ.J Neurosci Meth,1984,11:473陳長生，徐勇勇，曹秀堂.醫學研究中重復觀測數據的統計分析方法J.中國衛生統計1996，13(6)：554Davis KL,Thal LJ,Garmzu ER,et al.A double_blind,placebo_controlled multicenter study of Tacrine for Alzheimer's diseaseJ.New Engl J Med，1992，327(8):12535Rogers SL,Farlow MR,Doody RS,et al.A 24_week,double_blind,placebo_controlled trial of donepezil in patients with Alzheimer's diseaseJ.Neurology 1998，