1、幼物2010.31(4),7781ProgreKHinVeterinaryMedicine羊痘病毒及其疫苗研究進展趙忠荀點，矢國華。翩析敏'，張強'(1.中國農業科學院蘭州停醫研究所家俗佼病病旅生物學國家柬點實臉室農業部備腐病存學重點開放實驗室,甘肅蘭州730046,2.甘雨農業大學動物氏學院，什雨蘭州730070)摘要：國內外已時羊痕病畚及對*痕的預防控制做了大受的研究工作。¥痘痛毒的流行病學特征、分離及體外培恭、體外檢測已有了枝快的發展,而其致痛機制和基因蛆姑構、分子衣位、餡構蛋由及麻姑構殳血等分子生物學特征的研究尚待逐浙批入更加深入的稀究.近年來的研咒主奏是奸對

2、站構基因如p32的各臭找體的構建、表達和對非飴構思因如TK基因的研究及其缺失栽體的杓建、】RT的功能研究等等。會面而深入的分子生物學和免疫學丞礎的研究.將為發展更為有效的檢測珍斷方法，并為安會有效的亞單位疫苗、受組疫苗及枇酸疫苗的研制奠定基命。關鍵詢；羊痛病毒，毒力相關其因及蛋白TR基因及分子診斷，疫苗申圖分類號；幽52,654文獻標熾碼；A文SWI#：1007-5038(2010)04-0077-05收稿日期|2009-10-15基金項目：甘肅省科技重大寺頊計劃碩目(O92NKDAO32)作者簡介；必志茍(1984-),男(白棟).貴州人.碩去研完生，主婆從事前物痛去分子生物學學鳥允秋防治研

3、完.*通訊作者RNAiandItsApplicationonTreatmentofAnimalVirusDiseasesDUBin.HANLi-mei.ZHANGLeHei.LITiandai<ShenytmuAur'iculiuratUnivanUyShtnyang»Liaaning*1)0161.China)AbstrwctiRNAiisbeingwidelyused心anefficientgenesilencinKmethodduetoitsspecificitynndefficiency,EndogenousRNAiplnysanimportHnlroleinn

4、ntivirtilimmunityinplants.nemfltodvsandinsects,WhileinnuimmwlH.ititstilluncertainwhethertherearevirusspecificsiRNAandprotectiveRNAidefensesys-tem,loplemadeeffortstosetupnnefficaciouslyantiviralsysteminmammalianH.gainedmanyremarkableachievenieniH.Hndestablishedhnewpathforthepreventionandtrefttmentofv

5、irnldiseases.ThemechanismofRNAianditsapplientioninontivirnldiseasesinanimalwerereviewed.KeywordsiRNAinierferenceianimaliviraldisenae羊痘！W尚(upripfhrvirus.CPV)是最重要的動物痘陰毒在分類地位上屬于痘病毒科(Paruiridae)樣椎動物痘病毒業科(Oiordopo.rrimif)中的羊痘病毒屬(QipripaErus)成員，包括山羊痘病毒(Goatpax-viruatGPV)»綿羊痘病毒(Sheep/>arvirus§

6、PV)和牛姑背疹病毒(iMf/ipyskindiseasevirus.LS-DV)。作為山羊痘、綿羊痘和牛結節疹耕的致痛因子.CPV能引起這些動物最為嚴重的疾病孔在非洲、中東，中亞以及印度,SPV、GPV對小反芻獸產生r極大影響,在這個些地方它們的流行常常導致易慰動物很高的發病書和死亡卒f而相fi.LSDV限于非洲大陸和馬達加斯加存在，而且牛的納節性疹塊典發枕率不定，死亡率低最近幾十年.科研人員對CPV進行了大鼠:研究,許多實臉室都做了大量工作，試圖通過一步步深入的研究,能夠控制、消滅羊痘。隨著CPV基因組的公布，兒年的時間內，大M文獻報道了CPV研究情況.文章就CPV的分子生物學以及其相關疫

7、苗的研究進展做一蹤述.1病毒基本特征CPV為卵圓形或磚形病壽，胞漿內復制.共琪因組是雙饒D、A,其大小約為290nmX27Onm.CPV由1個核、2個側體和2層脂質外膜組成，屬于較小的痘病毒病毒粒子。CPV的衣殼有囊膜，囊膜內含有病毒特異性蛋白。核是由DNA和蛋白質組成的核蛋白復合體，位于病毒粒子的中央，呈兩面凹陷，凹陷內分布有2個側體。核和側體一起由脂蛋白性表面膜包圍，其間充填有可溶性蛋白，一層柵欄狀的核心膜緊貼于核心周圍。CPV對干燥有較強的抵抗力.在干燥的痂皮內可存活3個月6個月，在干燥羊舍內可存活6個月8個月反復凍融對其沒有明顯的滅活作用，但對直射陽光、常用消毒藥以及乙酰或氯仿敏感，放

8、線菌素-D和漠脂氧尿苜可抑制病毒復制。CPV可在牛、綿羊、山羊源的組織培養細胞上生長，原代、次代羔羊睪丸細胞和腎細胞最為敏感，也可用Ver。細胞等細胞系對CPV進行培養。CPV接種細胞后最早可在感染后4d使少量細胞出現細胞病變，之后的4d6d細胞病變迅速擴展到整個細胞層。觀察是否有CPE出現最多可達14d。2CPV的基因組結構CPV基因組較大，由143kb147kb堿基組成,A+T含地約為75%。CPV含有147個開放閱讀框(openingreadframe,ORF),編碼密度約為93%,能夠編碼53個2027個氨基酸。CPV的基因組由中間編碼區和兩端相同的反向末端重復序列(invertedt

9、erminalrepeatJTR)構成。中間編碼區(ORFs024123)是一個與痘苗病毒(Vaccineavirus,VV)基因的所有保守基因同源的核心編碼區域，其左側和右側的1027kb的基因結構中包含有重要的編碼功能的基因序列，含有基因編碼病毒復制的必需因子其參與病毒轉錄、RNA修正、病毒DNA復制、病毒粒子的構建和裝配等。兩端ITR(ORFsOOl023,ORFsl24156)長度均約為2.3kb,保守性較低.但含有一些功能基因家族，與病毒感染的宿主范圍、毒力等將性有關。這些基因家族包含5個ankyrin基因重復序列和3個kelch基因重復序列，還有一些細胞因子結合蛋白、IL10、表皮

10、生長因子樣蛋白、PKP抑制因子、絲氨酸蛋白酶抑制劑、痘病毒特異性毒力基因等的同源序列，它們編碼的蛋白質與病毒的修飾、病譚在宿主細胞中的逃逸、細胞凋亡以及免疫應答等有關"刃。ITR最末端是兩條鏈交叉連接的發卡環，緊接著是由兩套獨特序列隔開的串聯重復序列。SP-PV的ITR上的串聯重復序列大小為46bp,LSDV的為5bp,而在GTPV的ITR上則不存在串聯重復序列。3CPV毒力相關基因及蛋白研究概況3.1P32基因及其編碼蛋白3.1.1p32基因p32基因位于CPV基因組的6465kbp處，由第74號()RF編碼，是CPV基因組的長3.7kbp、PstI片段的一部分。HindDI、Ps

11、tJ片段含有5個ORF,分別與VV的J6R、H1L、H2L、H3L、H4L基因同源，即P32基因與編碼位于胞內成熟VV病毒粒子表面的p35蛋白的基因具有同源性。SPPV、GTPV的p32基因的閱讀框分別由323.322個氯基酸組成，分別由972bp、969bp的堿基編碼。它們在基因組成上高度保守，在核昔酸水平和氨基酸水平上分別有97.5%和94.7%的同源性皿。兩者P32基因最主要的區別是在SPPV的P32序列中的55位處是天冬氨酸，而在GTPV和LSDV中不存在。GTPV和SPPV的P32基因有兩個&oRV酶切位點，而在LSDV中則沒有EcoRV酶切位點的存在。3.1.2結構蛋白p3

12、2p32蛋白是從CPV感染細胞中分離得到的結構蛋白，分子質量為32ku°此蛋白為CPV的各毒株所共有且含有重要的抗原決定簇，它能夠刺激豚鼠迅速產生抗CPV的中和抗體。p32蛋白是CPV的囊膜蛋白，由319個324個氨基酸組成，具有跨膜的螺旋結構，該結構位于C端287位307位氨基酸處。現已證實p32蛋白是羊痘病毒屬特有的蛋白，存在于所有已分離的CPV毒株中，其單一血清可以中和CPV感染早期產生的抗體。因此P32基因可作為羊痘PCR診斷的目的基因。3.1.3P32基因克隆、表達及應用p32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的CPV共有且特異很強的結構蛋白。獲得可溶性的P32蛋白是進行CPV抗

13、體檢測以及進行亞單位疫苗研制的前提條件。因此到目前為止，基于P32結構蛋白進行的克隆、表達已相當多。國內外研究人員已構建了各種各樣的連接載體和表達載體，也取得了不同程度的成果。早在1994年,ChandP等利用大腸埃希菌表達了谷胱U肽S轉移酶融合和多聚組氨酸融合的重組P32蛋白，并以該重組蛋白作為抗原建立間接ELISA方法，而且證明了重組蛋白與正痘病毒和副痘病毒陽性血清均沒有反應。全長P32蛋白可溶性最大，且在ELISA中的反應性最好。近年來，國內不少研究人員擴增了P32基因，克隆至不同載體，并分別在原核和真核細胞中表達了有一定活性的目的蛋白。但由于P32蛋白的跨膜區對細胞具有毒性作用，使其表

14、達氐低，很難純化到重組P32蛋白以”。于是.國內外研究者便以截去跨膜區的P32基因為研究對象，研究其重組蛋白的用途。Chand'，等曾用截去跨膜區的重組p32蛋白為抗原，研究了檢測抗體的間接ELISA方法，該法快速、可靠，且沒有傳染性。但是最近的研究結果表明，全長P32蛋白截去跨膜區后，對其免疫原性有一定的影響3.2非結構基因及相關基因3.2.1TK基因的研究多種DNA病毒具有胸腺喧嚏核甘激醵基因(TK基因)編碼的胸腺啥嚏核存激酶。CPV的TK基因位于基因組中部ORF66處，距離兩端的ITR分別為52kb和91kb。TK基因編碼174個氨基酸的多肽，這些多肽與VV的J2R基因編碼多肽的

15、同源性約66%。在痘病毒科中不同屬的痘病毒TK基因的位置不同.在CPV.VV、雞痘病毒(Fowlpoxvirus.FPV)中TK基因分別位于基因組的3個不同的位置。AmanoH等猜測，這種位置的不固定性很可能是在痘病毒進化過程中，由于痘病毒的基因組重排造成的。盡管存在位置不固定，但TK基因均位于基因組的中間區域而且具有較高的保守性。CPV擁有龐大的基因組和許多非必需區，具有研究基因缺失疫苗和病毒活載體的巨大潛力。TK基因是CPV的主要毒力基因，也是病毒復制的非必需基因，缺失TK基因的CPV突變株在細胞中的復制能力極大減弱，因而使疫苗更安全。目前國內外已有不少關于TK基因重組病毒的構建。Bhan

16、uprakashV等口們利用TK基史作為非必需區構建了重組CPV。郭巍等i克隆了我國山羊痘弱毒疫苗(GTPV-TY)的TK基因，并利用同源重組構建了帶有同源重組曾和篩選標記的轉移載體。鄭敏5通過試驗研究獲得一株性狀穩定并保持形態、生長性能和免疫原性不變，但對山羊致病力降低的TK基因缺陷毒株；其整個試驗結果還證實了GTPV的scrpin蛋白可通過抑制caspase-8活性而抑制細胞凋亡。不過，目前GTPV缺失疫苗和活載體的研究依然處于起步階段。但是卜.述研究無疑也將會對活載體缺失疫苗的研制進一步奠定基礎。3.2.21TR基因及其在CPV分子診斷中的應用目前，國內應用PCR方法檢測CPV主要是針對

17、P32蛋白基因，但是針對p32蛋白基因檢測往往也存在不足.而對于同一樣本針對ITR基因片段進行擴增，能夠較容易的檢測出病毒的存在。因此，有人便基于ITR基因片段進行研究，試圖另外找到可應用PCR方法檢測的更為保守、敏感的CPV的基因片段。ManganaVO等頃用CPV的KS-1株和InS-1株的ITR為為目的基因設計引物建立了鑒別SSPV的簡單、快速、特異的PCR方法，能將SPPV與GTPV和皰疹病毒(Herpesviruses)區分開；Markoula-tosP等“a用ITR和a微管蛋巾為目的基因設計引物，建立了檢測皮膚組織中的SPPV和羊傳染性膿皰病毒(Contagiousecthymav

18、irus,CEV)的多重PCR技術，該技術采用3對引物、一步擴增方法，比用單一引物的PCR方法更快、更敏感。徐春志等:和王開功等分別應用PCR方法擴增山羊痘病毒QL、LD、Y、B-株反向ITR片段，并將其克隆至PMD18-T載體，構建了重組質粒PMD18-ITR,再將該重組質粒轉化DH5a感受態細胞進行培芥，對通過PCR、酶切鑒定為陽性的重組菌進行序列測定。徐春志等將所得序列與Gen-Bank收錄的2株山羊病毒、3株綿羊痘病毒全基因序列進行比較分析。結果所測4個毒株序列與GenBank上收錄的GTPV的該片段核昔酸序列的同源性均100%，與SSPV的該片段核曹酸序列的同源性均為98.3%。王開

19、功等研究也表明，4株病毒都可得到一條長度均為289bp的DNA片段，該片段可被內切酶AZ”I特異識另L而旦該PCR的DNA模板最小檢出量為24.40pg。與此同時，羅阿東等根據CPV的ITR的核甘酸序列設計引物，以CPV的DNA為模板，建立并優化了SYBRGreenI模式熒光PCR檢測GPV的ITR基因的方法，并與普通PCR方法進行敏感性比較。結果表明，建立的檢測GPV的SYBRGreenI熒光PCR方法能檢測出7X102拷貝數的DNA模板比文獻報道的普通PCR法更敏感、準確、快速。他們的研究結果均表明，ITR基因片段在羊痘病毒屬中也很保守，可以針對ITR基因建立CPV的PCR檢測方法。4CP

20、V分子檢測目前國內基于CPV不同的基因建立了不同的分子檢測方法，但是每個方法都不是完美的。如建立在P32基因的PCR方法，以及最近BalamuruganV等:偵構建的熒光定量:PCR方法均各自有不同的不足。而盡管基于重組P32建立的ELISA方法具有高度的特異性且與正痘病毒和副痘病毒沒有交叉反應，但由于全長P32表達量低，很難得以推廣使用。因此國內外不少研究人員K26）正研究CPV的其他特異性強、表達量高的功能基因，試圖建立出cPv的診斷檢測的新途徑。5疫苗研制、CPV傳統疫苗'國內外科研人員通過廣泛使用許多CPV毒株作為活疫苗，成功制備了二十多種滅活或弱毒疫苗。有的免疫后保護力可長達

21、1年以上.有的甚至終生免疫。我國使用的疫苗主要是1958年沈榮顯等將分離得到的GTPV太原株經過雞胚化致弱而制成的弱毒疫苗，其免疫期可達1年。而滅活苗往往只能提供暫時性的保護，因為以組織培養細胞制備的滅活疫苗的病毒粒子不具備完糖囊膜，接種動物后不能有效刺激機體產生對帶有完整囊膜的病毒粒子的免疫力。而且滅活疫苗通常不能有效激活細胞免疫，而CPV的免疫反應則主要是細胞免疫。所以滅活苗的效果常常不是很好。而旦活疫苗在非疫區使用時存在有病毒擴散的可能，所以尚需科研人員對CPV疫苗做進一步研究，期望在深入了解CPV的毒性和宿主范圍的基因基礎上，能夠增加疫苗設計的有效性和多功能性。5.1 CPV亞單位疫苗

22、P32蛋白是目前世界各地分離、鑒定的所有CPV共有且特異很強的結構蛋白，但是要獲得基于P32的CPV亞單位疫苗,必須先得到町溶性的P32蛋白。CarnVM等曾研究了大腸埃希菌表達的GST融合重組p32蛋白混合弗氏佐劑對試驗山羊進行肌肉注射接種，并對重組蛋白的保護性進行了研究。試驗結果證明將GSTP32配以佐劑接種山羊可以提高病毒中和抗體水平，降低CPV強毒感染.引起的臨床癥狀。雖然不能阻止病毒在攻毒部位的復制，但是可以阻止病毒向周圍的擴散，并旦使動物對病毒的反應更加敏感。但是在由于P32蛋白在表達的過程中會出現表達量低、表達不穩定等問題，這就在一定程度E制約著P32蛋白開發成亞單位疫苗的應用前

23、景。因此在CPV中尋找到免疫原性更好、表達量更大、表達更穩定的基因是十分重要的。5.2 CPV基因缺失疫苗CPV的宿主范圍專一，僅感染山羊、綿羊和牛這類反芻動物，因此更具有用作載體研制活載體疫苗的優勢。使用基因工程技術去除CPV的毒力相關的特定基因或基因片段可進-步獲得的缺失疫苗。目前大多數研究者都試圖通過缺失TK基因來實現。如王芳等構建TK基因缺失重組病毒以為獲得能區分自然感染和疫苗免疫的基因工程標記疫苗，郭巍等將LacZ基因表達盒插入TK基因缺失轉移載體篩選了TK基因缺失的GTP-VTY突變株。但是截至目前仍沒有正式使用CPV缺失疫苗進行免疫預防CPV的報道。隨著分子生物學的發展，人們對C

24、PV的認識逐漸深入。在基因組結構與功能、基因定位和基因表達調控等方面的研究不斷取得進展，這也將對研發更為有效安全的基因工程疫苗奠定基礎。6結論隨著分子生物學迅速發展，目前對CPV的研究已經逐漸更為全面而深入。在以P32蛋白為研究熱點以外，展開對CPV其他特異性強、表達量高的基因的深入研究2526.29.3。,將為更進一步解析病毒的功能提供依據。CPV毒力相關基因和決定宿主范圍的基因的鑒定以及其特性的研究，將會為全面理解宿主與病原之間的相互作用，為獲得新的更有效更特異檢測診斷方法以及重組疫苗的研制提供新的途徑。而對羊痘病毒更多復制非必需片段的篩選及更為有效的CPV載體的構建，也必將為反芻獸的傳染

25、病和其他動物疾病的控制產生深遠的影響。參考文獻：匚DialloA.ViljoenGJ.MercerAA.ctal.GenusPoxvirusescapripoxvirusM.Birkhauser.Basci,2007:167-181.2JDflmonfK.KnipeDM,HowleyPM.etnl.FiedsvirologyMJ.LippincottWilliams&Wilkins,Philadelphia,2007,2947-2975.3 BabiukS.BowdenTR,BoyleDB.ctal.Capripoxvirus：anemergingworldwidethreattosh

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