1、.綜述.輪狀病毒與細(xì)胞表面受體相互作用的分子機制研究張旭輝】綜述;周旭2,余黎I審校(1.蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，蘭州730046；2.上海生物制品研究所有限責(zé)任公司，上海200052)摘要：目的輪狀病毒是導(dǎo)致嬰幼兒重癥腹瀉的重要病因。輪狀病毒感染宿主細(xì)胞是一個多因素參與的復(fù)雜過程，包括病毒表面兩種外殼蛋白與細(xì)胞表面唾液酸、整合素、熱應(yīng)激同源蛋白70等多種受體分子的相互作用。就輪狀病毒與細(xì)胞受體相互作用的分子機制作了簡要論述。關(guān)鍵詞:輪狀病毒;唾液酸;整合素;熱應(yīng)激同源蛋白70;神經(jīng)氨酸酶;相互作用中圖分類號：R512.5文獻標(biāo)志碼：A文章編號：1005567

2、3(2012)06-0058-06ThestudyonmolecularmechanismofinteractionbetweenrotavirusandreceptorsoncellularsurfaceZHANGXu-hui*,ZHOUXu,YULi(*LanzhouInstituteofBiologicalProductsCo.,Ltd3CenterforGansuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,China)Abstract:Rotavirus(RV)istheleadingetiologicagentofsevere

3、dehydratingdiarrheaininfantsandyoungchildren.RotavirusentryforinfectionhostcellisacomplexmultistepprocessthatinvolvestheinteractionbetweentwosurfaceproteinsinHscandseveralreceptorsincells,includingsialicacids,integrinsandheatshockcognateprotein70.Inthispaper,thestudyonmolecularmechanismoftheinteract

4、ionbetweenrotavirusandcellularreceptorsisreviewed.Keyword：Rotavirus(RV)；Sialicacid(SA);Heatshockcognateprotein70(Hsc70);Neuraminidase(NA);Interaction病毒通過多種復(fù)雜的機制進入細(xì)胞內(nèi)部，大多數(shù)病毒進入細(xì)胞并具有感染性需要特異性的細(xì)胞受體介導(dǎo)。盡管病毒與細(xì)胞表面受體的這種相互作用并不能確保病毒有效地進入細(xì)胞，但這種相互作用是必須的一個環(huán)節(jié)'3。輪狀病毒(Rotavirus,RV)屬呼腸孤病毒科，是引起嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的重要病原體之一，其發(fā)生流行

5、不受衛(wèi)生狀況影響。由于目前尚無特效藥物治療RV引起的小兒腹瀉,疫苗接種仍是最有力的預(yù)防和控制措施。疫苗的研發(fā)進展很快，目前上市的用于預(yù)防輪狀病毒感染的疫苗為口服減毒活疫苗，提高病毒復(fù)制組裝效率,避免病毒組裝不完全現(xiàn)象的發(fā)生,是疫苗研發(fā)過程中必須解決的問題之一。病毒的吸附是病毒感染增殖的第一個環(huán)節(jié)，也是最為收稿日期：2012.10.19;修回日期：2012-11-15作者簡介:張旭輝(1984-),男，碩士研究生，主要從事病毒性疫苗的研發(fā)工作。通信作者:周旭,E-mail:kathzhou關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。病毒的吸附取決于病毒表面蛋白與細(xì)胞表面受體的相互作用，因此要對RV的分子結(jié)構(gòu)及RV與宿主細(xì)胞

6、間相互作用的分子機制進行深入研究，從而深刻理解影響輪狀病毒感染性的因素，為疫苗的研發(fā)奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。從分子水平就RV的外殼蛋白VP4、VP7與宿主細(xì)胞表面分子的相互作用進行論述,為進一步研究RV感染細(xì)胞機制、研發(fā)安全有效疫苗提供依據(jù)。1輪狀病毒的基本結(jié)構(gòu)RV是由3層同心蛋白質(zhì)衣殼包被基因組無包膜的雙鏈RNA病毒，呈二十面體，電鏡下呈“車輪狀”。病毒基因組由11個分節(jié)段的雙股RNA組成,指導(dǎo)合成12種病毒蛋白質(zhì)，包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(VP1VP4、6、7)和6種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSP1NSP6)。結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成病毒衣殼。其中，VP1、VP2和VP3為病毒核心蛋白。VP1為核糖核酸依賴的核糖核酸聚合酶，

7、在病毒的復(fù)制中發(fā)揮重要作用。VP2位于內(nèi)衣殼，可刺激病毒核糖核酸的復(fù)制。VP3為鳥昔酸轉(zhuǎn)移解,指導(dǎo)病毒基因組的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄。中層衣殼VP6由260個三聚體構(gòu)成，起連接VP7與VP2的作用，并影響內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄，為病毒內(nèi)衣殼蛋白,是病毒分組的特異性抗原。外層衣殼由VP4與VP7兩種蛋白組成，二者皆為中和抗原cVP4是位于病毒表面的刺突，是病毒的受體結(jié)合蛋白，具有重要的生物學(xué)功能，決定著RV的P血清型與感染性。VP7為病毒的外衣殼蛋白,決定著RV的G血清型，可以促進病毒進入細(xì)胞其他非結(jié)構(gòu)蛋白與致病性相關(guān),共同作用參與病毒的復(fù)制。輪狀病毒的感染性依賴于病毒顆粒的完整性,鈣離子為穩(wěn)定病再的重要離子，在乙二胺

8、四乙酸（EDTA）等鈣離子螯合劑的作用下病毒將失去外衣殼（VP4和VP7）而導(dǎo)致感染性度失。無感染性的雙層病毒顆粒DLPs（Doublelayerparticles）在VP4和VP7存在的條件下可重新裝配成為具有感染性的完整病毒顆粒。1.1外殼蛋白VP4VP4為輪狀病毒入侵細(xì)胞從而決定輪狀病再感染性的一個重要蛋白。VP4在胰蛋白悔的作用下裂解為VP5、VP8這種酮解作用可提高病毒感染性,更有利于細(xì)胞入侵。水解過程中，VP4（相對分子質(zhì)量88（）00）被裂解為VP8*（相對分子質(zhì)量28000,氨基酸殘基1231）和VP5*（相對分子質(zhì)量6（）000,氨基酸殘基248776）2個片段，剪切位點位于

9、第231.241和248位的精氨酸殘基,剪切產(chǎn)物仍留在病毒顆粒表而。體外實羚證明,經(jīng)胰蛋1?I酶處理的RV比未經(jīng)處理的病毒更容易進入細(xì)胞,且進入速度更快。值得注意的是，VP4含有與流行性感V病毒血凝素相似的結(jié)構(gòu)域這也許說明蛋白醉的水解作用是RV入侵的一個重要步驟，也解釋了為什么RV在小腸細(xì)胞內(nèi)（一個富含蛋白酮的環(huán)境中）易于復(fù)制的現(xiàn)象。VP4的功能結(jié)構(gòu)域如圖1所示。VP4VP5Trypsincleavage圖1VP4蛋白結(jié)構(gòu)圖Fig.IThestructureofP4prolein1.2外殼蛋白VP7VP7為RV粒子外殼中最豐富的蛋白，是由326個氨基酸殘基組成的鈣結(jié)合糖蛋白，鈣離子能穩(wěn)定外殼蛋

10、白2o研究發(fā)現(xiàn)病毒粒子的外殼蛋白VP7是由260個鈣依賴的VP7三聚體裝配而成,EDTA能誘導(dǎo)三聚體的解聚并促使病毒粒子脫殼音。在病毒粒子吸附至宿主細(xì)胞后VP7可以發(fā)揮作用協(xié)助病毒粒子進入細(xì)胞7o失去外殼蛋白的輪狀病毒DLPs不具備感染性，只有通過脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染才能感染易感細(xì)胞，說明病毒的外殼蛋白是病毒結(jié)合和內(nèi)化過程中所必需的xo不同株的RV其VP7蛋白含有不同的三肽及多肽基序結(jié)合區(qū)域，比如有LDV三肽（237239位氨基酸殘基）、GPR三肽（253255位氨基酸殘基）和CNP多肽（169位氨基酸殘基），分別與不同的細(xì)胞整合素受體岫31、ax陽和av/33相結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的功能wa。2細(xì)胞表面受體

11、與輪狀病毒感染性RV感染宿主細(xì)胞是一個復(fù)雜的過程，包括病毒和敏感宿主細(xì)胞在分子水平上的相互作用,這種作用說明了病毒感染的宿七范圍和種屬差衣RV感染時多種細(xì)胞受體觸發(fā)了病毒入胞的一系列事件，這是成功引起病毒增值周期所必須的，并且在病毒感染的組織趨向性和致病性中具有重要的意義。為了進一步研究RV與細(xì)胞表面受體的相互作用，人們應(yīng)用多種方法深入研究病毒感染所需的細(xì)胞受體的特性。Jolly等采用0.2%0G（辛基什D.毗喃葡萄糖昔）溶液去除了牛、猴、豬、人四株RV易感的MA104細(xì)胞和HT29細(xì)胞表面的受體成分，結(jié)果顯示顯著降低了RV的感染性。Guerrero等采用，環(huán)糊精去除MA104細(xì)胞表面的膽固醇

12、，再用RRV、nar3、Wa三株輪狀病毒感染處理后細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)這三株RV的感染性降低了90%刃。糖昔神經(jīng)鞘脂類、膽固醇、蛋白質(zhì)類能特異性地參與細(xì)胞膜脂筏的形成，而這些微脂筏結(jié)構(gòu)能介導(dǎo)病毒進入細(xì)胞內(nèi)部，從而影響RV的感染性。2.1輪狀病毒感染的細(xì)胞表面受體RV感染具有特異的細(xì)胞嗜性,僅感染小腸絨毛頂端的腸細(xì)胞，說明存在特異性的細(xì)胞受體。在體外,RV也呈現(xiàn)了嚴(yán)格的組織細(xì)胞趨向性，它能結(jié)合不同的細(xì)胞系但是僅能有效地感染腎上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞2J1o雖然對病毒的分子生物學(xué)和結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究都有了很大的發(fā)展，但是對于RV感染的細(xì)胞受體研究還不是很明確。通過對RV感染的敏感細(xì)胞表面受體分子進行研究，揭示了細(xì)

13、胞表面受體成分的另一個重要性質(zhì),即細(xì)胞表面影響病毒感染性的受體分子可以發(fā)生再生，如果在處理細(xì)胞后去除去垢劑，同時給予細(xì)胞生長的培養(yǎng)液，細(xì)胞可以在一定時間內(nèi)逐漸地部分恢復(fù)以至完全恢復(fù)對輪狀病毒的感染性。在這段時間內(nèi)，細(xì)胞自身完成了細(xì)胞膜表面受體分子的合成、轉(zhuǎn)運、聚集，從而有效地保證了病毒再次感染細(xì)胞。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),去垢劑處理后的細(xì)胞只需要8個小時就可完全恢復(fù)受體的再生，使得病毒重獲感染敏感細(xì)胞的能力。2.2輪狀病毒與細(xì)胞受體的相互作用許多細(xì)胞表面分子被認(rèn)為是RV感染的受體成分,最新的研究顯示完整RV顆粒與受體間的相互作用是復(fù)雜的。一個普遍的共識是受體介導(dǎo)的病毒感染模式，并且可能是RV外殼蛋白與多種

14、受體分子順序性的并相互協(xié)調(diào)的細(xì)胞特異性方式介導(dǎo)的多階段過程這些受體成分包括了唾液酸（SA,病毒感染細(xì)胞時最初吸附階段的重要成分）、整合素（如a2gl、a4/3l、ax陽、av°3,在吸附后階段與病毒外殼蛋白相互作用的）以及熱應(yīng)激同源蛋白70（Hsc70）o在RV與細(xì)胞受體的相互作用中，VP8*結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是與SA受體相結(jié)合的，而VP5*則與站81和Hsc70結(jié)合，VP7與a4/31、邳2和。昭3相互作用如。盡管對RV感染的細(xì)胞受體研究還存在一定的爭議，但目前的觀點認(rèn)為動物株RV感染宿主細(xì)胞時需要細(xì)胞表面SA的存在才能有效地使病毒結(jié)合并感染細(xì)胞，而人株RV感染時則不需要SA的存在t4J

15、3-，4o在體外，研究者用神經(jīng)氨酸酶（NA）處理MA104細(xì)胞，再用不同株RV感染細(xì)胞，通過間接免疫熒光實驗檢測病毒滴度，發(fā)現(xiàn)不同株的RV對細(xì)胞表面SA的依賴性是有區(qū)別的，借此可以將RV分為NA依賴型和非依賴型WE。然而，對于這樣僅憑單一標(biāo)準(zhǔn)的分類,許多研究者提出了一些疑問，對NA處理不敏感也不能意味著病毒感染就是SA非依賴性的，8_19o這些研究更進一步地指出NA敏感株RV能夠識別SA末端基序，而NA非敏感株RV則與SA中間基序相結(jié)合。對于大多數(shù)的RV而言，在病毒吸附階段是需要SA存在的，研究人員推薦用神經(jīng)節(jié)昔脂特異性來代替神經(jīng)氨酸酶敏感性的說法"I。基于對這樣的分類還沒有一個明確

16、的定論，目前依然選用最初的定義即NA敏感性來進行論述C最新的研究發(fā)現(xiàn),SA非依賴型RV,如人輪狀病毒P4、P6和P8型能識別人類組織血型抗原（Humanhisto-bloodgroupantigens,HBGAs）oRV的VP8,蛋白參與識別HBGAs,該抗原作為RV吸附至宿主細(xì)胞的受體。HBGAs作為在輪狀病毒的物種交叉?zhèn)鞑ブ锌赡艿囊蛩兀谳啝畈《靖腥九c進化中起著重要的作用：22'231o利用晶體學(xué)技術(shù),Hu等發(fā)現(xiàn)HBGAs結(jié)合人株RV的VP8*位置與SA結(jié)合動物株RV的VP8*位置是相同的，并且證實RV的VP8結(jié)構(gòu)發(fā)生的細(xì)微變化使得它能夠利用HB-GAs作為受體。這些研究提出了這樣

17、一種可能性,即全球不同人群中采用基因?qū)W手段可控地表達不同HBGAs,能夠影響一些特定人株RV對宿主的易感性和致病性。2.2.1的相互作用碳水化合物-蛋白質(zhì)相互作用在病毒感染中具有重要的意義。宿主細(xì)胞糖蛋白、蛋白聚糖類和糖昔神經(jīng)鞘脂類中的包含SA的糖基序被廣泛地認(rèn)為是病毒感染的受體2】。不同家族的病毒都利用包含SA的分子作為吸附受體,包括流感病毒？、腺病毒互、仙臺病毒"和呼腸孤病毒等。在RV感染過程中,SA被認(rèn)為是第一個而且是最重要的細(xì)胞受體之一，它通過與VP8,結(jié)合而發(fā)揮作用通過這種相互作用使得RV吸附至細(xì)胞表面，從而開始了RV感染細(xì)胞的第一步對于NA敏感型的RV（RRV和豬CRW-

18、8）來說，通過核磁共振光譜學(xué)的手段發(fā)現(xiàn)VP8*的核心部位與a-N-乙酰神經(jīng)氨酸相結(jié)合，這個結(jié)合位點是高度保守的,不再需要其他糖基序的參與，而對于NA非敏感型的RV株（人DS.1和Wa）VP8,是否也能利用相同的位點還不是很明確頃。研究發(fā)現(xiàn)，通過不同濃度的神經(jīng)氨酸酶處理RV感染敏感細(xì)胞，在NA敏感型的RV中病毒的感染性是降低的，而在NA非敏感型的RV中則不是很明顯，說明了還存在其他主導(dǎo)該種病毒株感染的因素。雖然這種RV株對神經(jīng)氨酸酶是抵抗的，從感染性上來看似乎并不對病毒的感染性產(chǎn)生很大的影響，事實上是該株病毒結(jié)合SA殘基的位點與NA依賴型RV不同，不能被NA的處理所裂解，并不能確認(rèn)SA對病毒的感

19、染性沒有作用oVP8'與SA的第一步相互作用使得病毒粒子錨定在細(xì)胞表面，VP8*與SA基序相互識別結(jié)合后，病毒外殼蛋白隨之發(fā)生構(gòu)象改變，以利于搜尋后續(xù)更多的特異性受體分子從而介導(dǎo)病毒下一步的入胞過程5.IO.32。2.2.2VP5*與整合素的伍的相互作用NA依賴型RV通過VP8,與SA相結(jié)合后，病毒外殼蛋白發(fā)生微弱的構(gòu)象改變，繼而通過VP5*的DGE-結(jié)合基序使病毒順序性地與第二個受體&發(fā)生相互識別并結(jié)合,結(jié)合位點位于VP5*的第308310位氨基酸殘基*。對于NA非依賴型RV而言,用是病毒感染中最重要的受體之一，比如nar3株RV對昆具有高的親和力。研究表明，包含DGE序列的

20、多肽和抗亞單位的抗體都能抑制RV的感染肉。%伙是RV感染的吸附受體還是吸附后受體，不同的研究者有不相同的結(jié)論。在對RV感染非敏感的CHO細(xì)胞上表達和缶亞單位后，使得RRV和WC3株RV的易感性提高了35倍。然而，整合素a2p.并沒有增強病毒與細(xì)胞的結(jié)合能力，可能在病毒的吸附后階段起作用O2.2.3VP7與展印、坤、坤的相互作用在RV吸附后階段，外殼蛋白VP7能與a4&l、坤和av保相互作用。這3個整合素受體分別能與VP73個不同的基序LDV、GPR和CNP相互識別并結(jié)合,結(jié)合位點分別為237239,252-255和161169位氨基酸殘基I""o抗a401、。必及叫

21、03單克隆抗體能有效地阻止病毒入侵細(xì)胞，但不能抑制病毒與細(xì)胞的結(jié)合，說明了挪1、Q瀏2、坤這3個受體與RV的相互作用發(fā)生于病毒結(jié)合后階段制。此外,通過在CHO細(xì)胞表面表達轉(zhuǎn)染的g和保兩個亞單位基因后，該細(xì)胞對輪狀病毒的感染性比未轉(zhuǎn)染前提高了34倍，而且將抗03的單克隆抗體與細(xì)胞孵育后，則這種感染性增強作用會得到抑制或。若聯(lián)合使用這3種受體的單克隆抗體作用于細(xì)胞，則發(fā)現(xiàn)能有效地阻止病毒與細(xì)胞的結(jié)合，說明這三種整合素在病毒侵入細(xì)胞的不同階段發(fā)揮著作用。2.2.4VP5.與Hsc70的相互作用Hsc70屬于分子伴侶，是熱休克蛋白（HSPs）家族成員之一，具有多種生物學(xué)功能，并且參與RV的感染539-

22、"。RV顆粒的VP5*與Hsc70特異性地相結(jié)合，結(jié)合位點位于該蛋白第642658位氨基酸殘基。研究發(fā)現(xiàn)抗Hsc70的單克隆抗體能特異地阻斷NA敏感型和NA非敏感型RV的感染性,使病毒感染性降低了80%。模擬VP5.的一段合成多肽（稱為KID基序）能夠抑制RRV的感染但不能阻斷與細(xì)胞的結(jié)合，說明VP5*與Hsc70的結(jié)合也是發(fā)生在病毒入胞的吸附后階段心。這種相互作用在NA敏感型和NA非敏感型RV的感染過程中都是存在的。通過不同的研究途徑，Jolly等發(fā)現(xiàn)了在CRW株的VP5*存在一個相似的區(qū)域（650657位氨基酸殘基）能夠與MA104細(xì)胞表面的受體相結(jié)合,也代表了該株RV與Hsc7

23、0的結(jié)合區(qū)域包含在K1D基序的區(qū)域在不同株的RV中并不是保守的，而且與Hsc70的作用也沒有序列特異性。令人可喜的發(fā)現(xiàn)是DLPs和合成肽（VP6氨基酸殘基280297）能夠在兩種不同的細(xì)胞系中，以劑量依賴方式抑制不同RV株的感染性M3。DLPs所呈現(xiàn)出來的這種與Hsc70的相互作用提示RV粒子VP6在病毒感染細(xì)胞中也伴有一些功能。3總結(jié)從分子水平探討并研究RV與敏感細(xì)胞表面受體的相互作用，進而深入研究RV的感染性質(zhì)，對科學(xué)合理地指導(dǎo)輪狀病毒疫苗的研發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。不同來源的RV株通過外殼蛋白與不同的細(xì)胞受體相互作用，從而介導(dǎo)病毒進入細(xì)胞內(nèi)部完成增殖周期，然而很多環(huán)節(jié)的作用機制還不是很清楚

24、，需要進一步更加深入的探索研究。通過對RV敏感細(xì)胞的研究，可以揭示影響病毒感染性的因素,為分析并解決RV疫苗研發(fā)當(dāng)中如何提高病毒對細(xì)胞基質(zhì)的感染率及復(fù)制效率等問題提供一種新的解決思路。不僅如此,在病毒性疫苗研發(fā)過程中選擇安全有效的細(xì)胞基質(zhì)也是非常重要的環(huán)節(jié)和因素，這將會為其他更多病毒性疫苗的應(yīng)用研發(fā)提供新穎的思路與理念。參考文獻1KnipeDM,HowleyPM.Fields'VirologyM.4thed.,Philadelphia:LippincottWilliamsandWilkins,2001:1787-1833.2FlemingFE,GrahamKL,TakadaY,etal

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