1、第27卷第5期2012年10月文章編號：2095-476X(2012)05-0013-05鄭州輕工業學院學報(自然科學版)JOURNALOFZHENGZHOUUNIVERSITYOFLIGHTINDUSTRYNaturalScienceEdition)腸道病毒71型的診斷方法及疫苗研究述評董彩文張勝楠I,王云龍2。李玉林3,孫新城二王國強李恒思3(1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，河南鄭州450002；2. 鄭州職業技術學院生物工程系，河南鄭州450121；河南省生物工程技術研究中心，河南鄭州450001)摘要：對腸道病毒71型的診斷方法及疫苗研究進行了綜述.EV71的診斷有病毒分離培養、

2、中和抗體滴度檢測、核酸檢測和免疫學檢測;EV71的疫苗研究主要為國內流行的C4型毒株，經過動物模型評價研發減毒活疫苗、病毒樣顆粒疫苗和針對VP1位點的重組疫苗.采用兩種或兩種以上診斷方法聯合使用為EV71的快速診斷提供一種有效方法；而建立合適的動物模型，篩選免疫原性和交叉保護水平高的毒種，以及不同類型疫苗免疫原性比較是疫苗研究的方向.關鍵詞：腸道病毒71型；免疫學檢測；疫苗中圖分類號:Q819；R392文獻標志碼：AD01：10.3969/j.issn.2095-476X.2012.05.003Reviewofdiagnosismethodsandvaccineresearchofentero

3、virus71DONGCai-wen1,ZHANGSheng-nan1,WANGYun-long23,LIYu-lin3,SUNXin-cheng1,WANGGuo-qiang3,LIHeng-si3(1.CollegeofFoodandBioeng.,ZhengzhouUniv,ofLightInd.yZhengzhou450002,China；Dept,ofBioeng.ZhengzhouTechnicalCollege,Zhengzhou4501219China；2. He"nanBiotech.ResearchCenter,Zhengzhou4500019China)Abst

4、ract:Thediagnosismethodandvaccineresearchweresummarized.Thereareseveraldiagnosismeth-.odsforenterovirus71(EV71),suchasseparationandcultureofvirus,titertestofneutralizingantibody,nucleicaciddetectionandimmunologicalassay.ThemainresearchcontentsofEV71vaccineareattenuatedlivevaccinebasedontheC4strainan

5、devaluatedthroughanimalmodel,viruslikeparticlevaccineandrecombinantvaccineaimedatVP1site.ItisprovidedoneeffectivemethodforrapiddiagnosisofEV71combineduseoftwoormorediagnosisassay.Thefoundationofsuitableanimalmodel,thescreeningofvirusstrainwithhighimmunogenicityandcrossprotection,andthecomparisonofim

6、munogenicityfordifferentvaccinearethedirectionofvirusresearch.Keywords:enterovirus71；immunologicaldetection；vaccine收稿日期：2011-12-15基金項目：河南省科技創新杰出青年項目(114100510024)作者簡介：董彩文(1970),男，湖北省武穴市人，鄭州輕工業學院副教授，博士，主要研究方向為生物技術和食品安全檢測.0引言腸道病毒71型EV71（enterovirus71）是一種嗜神經腸道病毒，由EV71引起的手足口病在亞洲頻繁暴發，造成很高的發病率和死亡率.為了能對EV7

7、1引起的手足口病做到早發現、早治療，尋找快速診斷方法、開發有效的抗病毒藥物及安全的預防疫苗已經成為科技工作者研究的重點.EV71VP1基因編碼蛋白分布有多個磷酸化位點，具有較多的生物功能位點和潛在的抗原表位區域，是免疫診斷、藥物作用研究及疫苗研制的靶抗原，可為EV71診斷、治療及預防方面的應用提供重要的參考依據.本文將就EV71引起的手足口病的免疫學診斷方法、疫苗的開發進行綜述.I EV71診斷方法的研究進展由于腸道病毒屬成員數量多，且具有相似的結構和生物學特性，因此臨床診斷困難.柯薩奇病毒A16的爆發往往伴隨著EV71的流行，而兩者的主要癥狀均表現為手足口病，在臨床上非常難以區分;另外,EV

8、71還可引起與脊髓灰質炎病毒同樣的中樞神經系統癥狀，因此EV71是腸道病毒中最難鑒定的病毒之一.目前國內外的相關報道中，關于EV71的診斷方法主要有病毒分離培養、中和抗體滴度檢測、核酸檢測和免疫學檢測等2-6】.II EV71的分離培養病毒分離培養是EV71病毒常用的實驗室診斷方法，也是EV71病毒鑒定的金標準.主要用人上皮癌細胞（Hep-2）、綠猴腎細胞（Ver。）和人橫紋肌癌細胞（RD）等細胞系擴增從患者皰液、咽拭子或糞便標本中分離病毒.目前已成功從患者糞便、腦脊液、血液、咽拭子及皰疹液中分離到EV71病毒.12 EV71中和抗體滴度檢測比較患者恢復期血清與急性期血清中和抗體滴度，可用作腸

9、道病毒感染的血清學診斷方法.最常用的是微量板法測定抗體滴度，作為腸道病毒感染的診斷方法之一，此法是目前最常用的人腸道病毒抗體檢測方法，具有精確旦特異性好等特點.當急性期血清與恢復期血清中抗體滴度為4倍或4倍以上，則證明病毒感染.張軍等3在2009年建立了新型EV71中和實驗方法，前期的實驗操作與傳統方法一致，不同的是在病毒感染細胞后14h即可檢測.與傳統TCID50方法相比,新畫的EV71中和實驗方法的操作周期較短,只需要30h即可完成對EV71和抗體的檢測,同時采用Elispot自動掃描檢測，可避免人工操作帶來的視覺差，更能夠滿足快速高通量篩選的要求.13 EV71的核酸檢測1.3.1逆轉錄

10、RT-PCR技術目前，逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術已經成為腸道病毒感染快速診斷的重要手段，李國蘭等用RT巢式PCR快速檢測EV71病毒核酸:腸道病毒通用引物檢測陽性率為72.6%,EV71特異性引物檢測陽性率為58.9%.腸道通用引物在45例重癥患兒和50例輕癥患兒的病毒陽性檢出率分別為68.9%和76.0%,P>0.05,并無顯著性差異.EV71特異性引物在45例重癥患兒和50例輕癥患兒的病毒陽性檢出率分別為57.8%和60.0%,F>0.05,并無顯著性差異.95例患兒CA16引物檢測結果均為陰性.1.3.2實時熒光定*PCR實時熒光定量PCR是在PCR反應體系中引入

11、特定的熒光標記基團，通過對積累的熒光信號的收集來實現對整個PCR反應過程的實時監測，最后通過繪制出的標準曲線對樣品中待檢模板含量進行定量分析.陳應堅等在對16例已收集到的患者的糞便、皰疹液標本進行檢測時，用實時熒光PCR方法檢測到8份陽性樣本，陽性率為50.0%,而用逆轉錄聚合酶鏈反應方法檢測到5份陽性樣本，陽性率為31.3%.實時熒光PCR技術具有特異性強,靈敏度高的特點，且能在采樣后數小時內檢測到病毒的RNA,從而達到快速診斷的目的.1.3.3基因芯片技術基因芯片技術是借助一定的方法（壓電打印法、原位合成法、分子印章法等）,將設計的DNA片段固化到一定載體（硅片、醛基化的玻片、表面氨基化等

12、）表面,在特定條件下與熒光標記的樣品分子進行雜交，通過激光共聚焦顯微鏡等設備收集信號，并用生物信息學軟件對其分析,從而獲得樣品的遺傳信息.目前國外已有公司研發出腸道病毒鑒定芯片（EVtypingchip），可快速檢測出腸道病毒的型別.國內目前未見使用基因芯片對腸道病毒進行檢測的相關報道.14 EV71的免疫學檢測EV71的確診是在臨床診斷的基礎上,EV71核酸陽性、分離出EV71病毒或EV71IgM抗體檢測陽性,EV71IgG抗體4倍以上增高或陰性轉為陽性來判斷的.然而，常規病毒分離培養法雖可用作EV71診斷的直接證據,但其操作繁瑣、周期也太長;中和抗體滴度檢測具有精確且高度特異性等特點，但存

13、在不明顯的隱性感染，且對毒株的穩定性要求較高；由于EV71和柯薩奇病毒A16等其他腸道病毒基因組的核昔酸序列具有一定的同源性，因而核酸檢測試劑盒在實際操作過程中容易出現假陽性免疫學檢測主要是利用抗原和抗體的特異性反應進行檢測的一種手段，并可利用同位素、酶和化學發光物質等對檢測信號進行放大和顯示，常被用于蛋白質、激素等微量物質的檢測.常見的EV71免疫學診斷方法正是運用了酶聯免疫法(ELISA)檢測.楊國威等利用巴斯德畢赤酵母表達重組蛋白VP1，檢測58份非病人血清和98份病人血清(其中IgM陽性血清51份,IgG陽性血清47份).結果顯示，對IgM陽性血清，其特異度為93.1%,靈敏度可達90

14、.2%；而對IgG陽性血清，其特異度為93.1%,靈敏度高達93.6%,證實重組蛋白VP1可用來制備ELISA診斷試劑盒.SR.Shih等曾用EV71VP1基因的原核表達產物作為抗原診斷EV71感染，結果表明VP1既可用于檢測曾感染EV71患者血清中的IgG抗體，也可用于檢測急性感染期患兒血清中的IgM抗體，而且與柯薩奇病毒A16抗血清無交叉免疫反應.S.Y.Wang等"°】將商業化的抗人EV71-IgM抗體作為包被抗原建立了早期、快速診斷EV71感染的IgM診斷試劑盒.眾多研究者表達純化出具有免疫活性的EV71VP1蛋白，建立了手足口病患者抗EV7MgM和IgG的血清學診

15、斷方法.鑒于ELISA檢測方法的深入研究，目前已有國家批準的EV71IgM和IgG抗體診斷試劑盒用于臨床診斷，成為對EV71感染者的早發現、早診斷、早治療的一種有效手段.2EV71的疫苗研究目前關于EV71抗病毒藥物的研究大多為體外研究或動物實驗,研發預防手足口病的EV71疫苗是首要的控制措施.近年來國內已有多家企業采用不同來源的毒株及不同工藝進行EV71疫苗研發,在疫苗毒株的篩選和確定、細胞基質的選擇、滅活工藝的優化和驗證、質量控制、疫苗的免疫原性、動物模型評價等方面都取得了較大進展.目前開發EV71疫苗的毒株主要為國內流行的C4型毒株，采用的細胞基質主要為Vero細胞或人二倍細胞，多選擇全

16、病毒滅活工藝，采用發酵罐、細胞工廠或轉瓶工藝生產.2.1動物模型在疫苗研發進入臨床研究之前,動物模型是評價疫苗免疫效果的關鍵指標.目前用于開發EV71疫苗的動物模型主要是乳鼠模型和猴體模型，但均存在一定問題.乳鼠模型感染的日齡偏小，最多為2周方，而且并非所有的EV71病毒均能建立乳鼠模型.由于靈長類動物與人類的親緣關系最為接近，撈猴或恒河猴可用于EV71病毒感染的研究模型l4-15.但多數實驗室猴體模型存在動物來源困難、飼養環境要求高、運輸條件苛刻、試驗費用高等問題,給大規模的疫苗研究帶來一定困難.2011年竇建林等3】通過病毒馴化，獲得的EV71神經細胞適應毒株，可用于構建手足口病動物模型，

17、也有助于研究EV71免疫學發病機制.就目前研究進展來看,建立一種合適的動物感染模型對于EV71疫苗仍具有重大的研究意義.2.2減毒活疫苗早期的研究證明福爾馬林滅活疫苗的免疫保護效果優于VP1DNA疫苗和VP1原核表達亞單位疫苗.Y.C.Lin等的研究提出一種適宜實驗室培養的減毒株K/V3-4a,其優越的特性都符合制備滅活疫苗的要求.M.Arita等3】構建出EV71減毒株EV71(Sl.3'),其研究結果表明EV71(S1-3')其有良好的抗原性，是一種有前景的候選疫苗.張雪梅等】研究認為EV71滅活疫苗可以在恒河猴嬰猴體內誘導良好的免疫反應，而且具有良好的安全性.S.C.Wu

18、等認為改良微載體技術能使EV71滅活疫苗的生產達到工業化規模.C.C.Liu等】發現無血清微載體細胞培養技術也可以有效生產EV71滅活疫苗.高孟等建立了一種特異性好、靈敏度高、重復性好、簡單方便的測定EV71病毒滅活疫苗抗原滴度的檢測方法.2010年，由北京微谷生物醫藥有限公司、中國疾病預防控制中心和中國食品藥品檢定研究院聯合開發的EV71滅活疫苗首獲國家食品藥品監督管理局簽發的臨床研究批件，這將為我國提供安全有效的手足口病預防用疫苗，對有效控制手足口病疫情具有重要的現實意義.2.3病毒樣顆粒疫苗EV71病毒樣顆粒(VLP)能引起較強的抗EV71免疫應答,不含病毒核酸，具有很好的安全性，有望成

19、為預防EV71感染的疫苗.C.Y.Cheng等咨構建了重組桿狀病毒(BAC-P1-3CD)和BacPlI3CD,在較弱的巨細胞病毒和IE-1啟動子下分別表達3CD蛋白.免疫印跡和ELISA分析表明,Bac-Pl-C3CD和Bac-PM3CD會導致VLPs釋放到Sf-9細胞的上清,并且增強其在Sf-9細胞中的產量，但卻在HighFiveTM(Hi-5)細胞中VLPs產量極低.通過優化工藝參數后,產生的VLPs與從Bac.Pl.3CD感染產生的VLPs,不僅在密度、大小和形狀方面相似，而且還會在小鼠模型中誘發強有力的抗體反應,產生的抗體可以中和同源和異源基因組的EV71株，同時指出VLPs對手足口

20、病流行具有交叉保護潛力.該研究表明,Bac-Pl-C3CD和優化的工藝使VLPs大規模生產更為經濟，解決了需要細胞裂解液的困難，并有希望用于將來的工業疫苗生產.2.4針對VP1位點的重組疫苗曾有研究者表達VP1基因構建了EV71重組疫苗,也有將VP1基因轉入小鼠或西紅柿制備口服轉基因疫苗，均取得一定保護效果26-28.D.G.Foo等網針對EV71B4亞型的外膜蛋白VP1設計多肽疫苗,設計出2個肽段SP55和SP70,分別包含VP1的氨基酸163177和208222,實驗證實兩者具有作為合成肽疫苗預防EV71感染的潛力，而且SP70可成為一種制備EV71疫苗的備選合成肽.S.Y.Ho等區將3拷

21、貝的SP70(208222aa)基因插入減毒百日咳桿菌構建嵌合菌體，試驗證實其具有中和病毒的作用.x.LLi等加用SP55和SP702種合成肽，免疫小鼠產生單克隆抗體，并經免疫印跡分析及免疫組化驗證其特異性，認為克隆22A12在體外中和實驗中呈現強中和活性，有望用于治療EV71感染.最近，中國疾病預防控制中心制成EV71病毒基因工程疫苗，已獲得專利g.W.C.Chng等:用一種具有ev71VP1片段(NPt.VPll.100)的重組新城疫病毒外殼蛋白感染新生小鼠模型，結果表明NPt-VPll-100能對EV71感染具有部分保護作用，可以作為抗EV71感染的潛在疫苗.另外，研究發現EV71在不同

22、人腦組織有交叉反應,而且這種交叉反應與病毒的2種結構蛋白有關,2010年J.N.Liu等可選擇了沒有交叉反應的六肽，并組合成3種備選疫苗，免疫幼鼠以評價其免疫效果.研究指出由結構蛋白上的肽段P70-159,P140249,P324443,P746876組成的Vac6,對主要由EV71C4亞型引起的手足口病具有潛在預防價值.目前雖未發現針對EV71重癥患者的有效治療藥物,但預防疫苗的研究已有突破性進展.T.C.Wu等可研究認為EV71與柯薩奇病毒A16型有許多共同的多肽表位，針對柯薩奇病毒A16型的體液免疫和細胞免疫對EV71感染有交叉預防作用，目前已有針對這2種病毒引起的手足口病疫苗獲得專利.

23、另外，鑒于國內外將免疫乳用于預防疾病的研究頃1,將純化的基因工程抗原EV71VP1免疫奶牛制備的免疫乳用于EV71引起的手足口病預防也是一個新的思路.3展望目前，人類已經建立了很多種EV71的檢測方法,但在臨床應用上都有一定的局限性，很難同時滿足準確、快速、簡便、易于普及等要求.雖然ELISA法具有敏感、特異、廉價和快速等優點，也可滿足現場檢測及大規模普及等需求，但仍受兩方面的限制:一方面，高病毒含量的樣本采集較困難,另一方面,EV71在人群中存在很大比例的隱性感染.隨著體外診斷試劑的不斷發展，國內外關于疾病的檢測診斷涌現了許多新思路，主要表現在兩種及兩種以上診斷方法的聯合使用，這樣可以最大限

24、度地利用各種檢測方法的優勢，這也為EV71的診斷提供了一條新思路.建立合適的動物模型,篩選免疫原性和交叉保護水平高的毒種，以及不同類型疫苗免疫原性比較是疫苗研究的重點.參考文獻：1 徐溥緒，周惠玲，崔穎鵬，等.腸道病毒71型VP1基因及蛋白結構與功能的生物信息學分析J中華傳染病雜志,2010,28(7)：408.2 ShihSR,LiYS,ChiouCC.ExpressionofcapsidproteinVP1foruseasanantigenforthediagnosisofenterovirus71infectionJ.MedicalVirology,2000,61(2)：228.3 張軍

25、，蔡毅君.腸道病毒分離鑒定及EV71快速高通量中和實驗方法的建立D.廈門：廈門大學，2009：33-78.4 李靜，蔡芳，高強，等.EV71病毒特異性單克隆抗體的篩選及鑒定J.細胞與分子免疫學雜志,2009,25(7):623.5 李國蘭，郭玲，李治悅，等.RT-PCR法在快速檢測腸道病毒71型(EV71)核酸中應用J.安徽醫學,2008,29(4)：363.6 馬文麗，鄭文嶺.DNA芯片技術的方法及應用M.廣州：廣東科技出版社,2002.7 陳應堅，李水明，徐亞軍.應用熒光定量PCR技術檢測腸道病毒71型J.現代預防醫學,2010,37(2)：339,程獻，徐詠書.手足口病EV71的實驗室診

26、斷J.實驗與檢驗醫學,2008,26(3)：2868 楊國威，何雅青，薛穎，等.腸道病毒71型外殼蛋白第5期VP1在Pichiapastoris酵母中的表達J.病毒學報，2003,19(2):114.9 WangSheng-Yu,LinTsuey-Lih,ChenHour-Young,etal.Earlyandrapiddetectionofenterovirus71infectionbyanIgM-captureELISAJ.JofVirologicalMethods,2004,119：37.10 謝靖靖，楊桂林,劉映霞，等.腸道病毒71型手足口病ELISA診斷試劑盒研制與臨床應用J.中華檢

27、驗醫學雜志,2009,32(11):1262.11 馬洪濱，侯俊，李魯平，等.腸道病毒71型血清學檢測方法的建立及應用J.解放軍醫學雜志，2010,35(3)：239.12 ChenSC,ChangHL,YanTR,etal.Aneight-yearstudyofepidemiologicfeaturesofenterovirus71infectioninTaiwanJ.AmJTropMedHyg,2007,77(1):188.13 DongC,WangJ,LiuL,etal.OptimizeddevelopmentofacandidatestrainofinactivatedEV71vacc

28、ineandanalysisofitsimmunogenicityinrhesusmonkeysJ.HumVac-cine,2010,6(12)：1028.14 王晶晶，張雪梅,趙紅玲，等.人腸道病毒71型感染免疫抑制恒河猴的分析J.中國病理生理雜志，2011,27(7):1249.15 竇建林，安靜.EV71型病毒馴化與手足口病動物模型的研究進展J.免疫學雜志,2011,27(3):259.16 WuCN,LinYC,FannC,etal.Protectionagainstlethalenterovirus71infectioninnewbornmicebypassiveimmunizati

29、onwithsubunitVP1vaccinesandinactivatedvirusJ.Vaccine,2001,20：895.17 LinYC,WuCN,ShinSR,etal.Characterizationofaverocell-adaptedvirulentstrainofenterovirus71suitableforuseasavaccinecandidateJVaccine,2002,20(20)：2485.18 AritaM,NagataN,IwataN,etal.Anattenuatedstrainofenterovirus71belongingtogenotypeasho

30、wedabroadspectrumofantigenicitywithattenuatedneurovirulenceincynomolgusmonkeysJ.JofVirology,2007,81(17)：9386.19 張雪梅，趙紅玲,王晶晶，等.腸道病毒71型滅活疫苗在嬰猴保護性實驗中的病理性炎癥反應J.中華醫學雜志,2011,91(28):1977.21WuSC,LiuCC,LianWC,etal.Optimizationofmicrocarriercellcultureprocessfortheinactivatedenterovirustype71vaccinedevelopmen

31、tJ.Vaccine,2004,22：3858.22 LiuCC,LianWC,ButlerM,etal.Highimmunogenicenterovirus71strainanditsproductionusingserum-freemicrocarrierVerocellculturelJ.Vaccine,2007,25：19.23 高孟，周康鳳，姜云水，等.一種測定腸道病毒71型滅活疫苗抗原滴度的檢測方法P.中國專利：CN101881774A,2010-06-22.24 ChungYC,HoMS,WuJC,etal.Immunizationwithvirus-1汰eparticlesof

32、enterovirus71elicitspotentimmuneresponsesandprotectsmiceagainstlethalchallengeJVaccine,2008,26：1855.25 ChengCY,ChenCY,LinSY,etal.Enterovirus71virus-likeparticlevaccine:ImprovedproductionconditionsforenhancedyieldJ.Vaccine,2010,28(43)：6951.26 TungWS,BakarSA,SekawiZ,etal.DNAvaccineconstructsagainstent

33、erovirus71elicitimmuneresponseinmiceJ.GenetVaccinesTherapy,2007(5)：6.27 ChenHL,HuangJY,ChuTW,etal.ExpressionofVP1proteininthemilkoftransgenicmiceapotentialoralvaccineprotectsagainstenterovirus71infectionJ.Vac-cine,2008,26(23):2882.28 ChenHF,ChangMH,ChiangBL,etal.OralimmunizationofmiceusingtransgenictomatofruitexpessingVP1proteinfromenterovirus71J.Vaccine,2006,24：2944.29 FooDG,MacaryPA,AlonsoS,ela