1、舟山眼鏡蛇毒CTX1層析分離的流速優化*周升銘，董偉華，孔天翰.（廣州醫學院病理生理學教研室，廣東廣州510182）摘罷目的比較3種流速的CM-SepharoseFF陽離子交換層析注分離舟山眼鏡蛇（.Najanaja蛇毒（snakevenom.SV）的柱效，為SV的分離純化提供實驗依據.方法（1）采用3種流速CM-SepharoseFF陽離子交換層析柱分離舟山眼鏡蛇蛇毒；（2）反向高效液相法分析各蛆分的純度及內標法與CTX1標準品比較指紋圖譜.姑果經過陽離子交換層析.可從蛇毒中獲得7個組分（組分17）.當流速為1.4ml/min和1.8ml/min時，得到的7個組分中.組分SV1和SV2.組分

2、SV3和SV4.組分SV5、SV6和SV7組分之間分離效果較差；當流速為1.6mi/min時.各組分的分離效果理想.HPLC分析顯示，組分SV5、組分SV6都是簞一成分.純度分別為95.8%、93.6%；CTX1內驚法顯示.組分SV6與CTX】指紋圖譜吻合.詁論CM-SepharoseFF用于蛇毒分離可獲得較高純度的單一有效成分，流速為1.6ml/min分離效果佳.美詢舟山眼鏡蛇；蛇毒；純化；鑒定中圖分類號R996.3文獻標識碼A文章號1001-5639（2011）02-0096-06doi：10.3969/j.isj*n.1001-5639.2011.02.002Flowvelocitiyo

3、ptimizationofisolationmethodsforcomponentCTX1ofNajanajaatravenom*ZHOUSheng-mingDONGWei-hua,K()NGTian-han*(DepartmentofPathophysiology,GuangzhouMedicalCollege,Guangzhou,Guangdong,510182,China)Abstract-ObjectiveComparingthecolumnefficiencyofthreeflowvelocitiesinCM-SepharoseFFion-exchangechromatography

4、gelchromatographyonisolatingNajanajaatrasnakevenom,itisordertoresearchanddevelopnewmethodtopurificateandcharacterizateSV.Methods(l)IsolationandpurificationofvenomwasdonebysuccessivechromatographyCM-SepharoseFastFlowinthreeflowvelocities,(2)ThecharacterizationsofthisproteinwerestudiedbyHPLC.ResultsSe

5、vencomponents(SVlSV7),wereobtainedfromNajanajaatrasnakevenombyCM-SepharoseFFchromatographycolumn.Whenflowvelocitychangedfrom1.4mi/minto1.6ml/minto1.8ml/min,SVdonotbeenseparatedcompletelyatflowvelocity1.4ml/minand1.8ml/min,whilebeenseparatedcompletelyatflowvelocity1.6ml/min.HPLCanalysisindicatedSV5an

6、dSV6weresterling.Thepuritywere95.8%and93.6%.HPLCinternalstandardmethodanalysisindicatedthatSV6wasthesamewithCTX1infingerprint.ConclusionTheparametersaboutflowvelocityof1.6ml/minlineargradientweremoreoptimuminisolationandpurificationofSVinthisexperiment.Keywords:Najanajaatraisnakevenomjpurification；c

7、haracterization蛇毒是由蛋白質、多肽、酶類和其他小分子物質組成的混合物.具有大量的生物學活性，如神經毒、心臟毒、細胞毒、出血毒、磷脂酶A、血液和血管活性成分及多種酶類等。蛇毒中有不少成分分離純化后已應用于臨床，如安可洛、立止血、降纖酶、東菱克栓酶、薪蛇酶等，也有一些作為工具藥廣,基金攻目：廣州市科技局資助項M（No.福科條字20056號）,通訊作:E-mail:Kongth泛應用于生理和藥理研究。心臟毒素（Cardiotox-ins）是蛇毒中一類重要的活性組分，由6063個氨基酸組成，空間結構呈三指結構，因其分子中由致密的內核伸展出3個指狀肽鏈環而得名。有報道，用熱板法測定舟山眼

8、鏡蛇毒Cardiotoxin-1f的鎮痛作用實驗發現對急性動物疼痛模型有顯著鎮痛作用。對蛇毒原毒的分離方法有很多研究報道，Braganca等）采用Sephadex-G50凝膠過濾、CM-cellulose層析等對眼鏡蛇（Najanaja”尸。）粗毒進行洗脫，從洗脫的4個吸收峰中分離出CTXP6。杜雨蒼等采用SP-SephadexC-25柱上平衡層析方法，從廣東產眼鏡蛇毒中純化出細胞膜毒素D1。為了優化CTX1分離純化流程，提高分離效率.本研究利用離子交換層析技術一步法對樣品進行了分離純化研究，通過選擇不同流速，以期尋找最佳的分離參數，實現從原毒分離CTX1的最佳分離效率，并為新藥開發應用提供實

9、驗依據。1材料與方法1.1蛇毒實驗用舟山眼鏡蛇（Najanajaatra）蛇毒原毒，由廣州醫學院病理生理學教研室提供。1.2 主要試劑和儀器（1）試劑：CM-SepharoseFFCGEHealthcare）,色譜純三氯乙酸（TFA）、乙臘（ACNX德國Merck公司）；Tris-HCl（北京鼎國生物科技有限公司）。（2）儀器：ShimadzuLC-10AD高效液相色譜儀.SPD-10AUV-VIS檢測器、N2000色譜工作站（日本島津公司）;Arium631超純水系統（德國Sartorius公司）；Alpha1-4/LSC真空冷凍干燥系統（德國Christ公司）；HD-3000型電腦核酸蛋白

10、檢測儀（上海嘉鵬公司）;3K30溫高速離心機（美國Sigma公司）；電子分析天平（日本A&D公司）；電導率檢測儀（上海精科儀器廠）；pH檢測儀、層析柱05.5cmX50cm）（海華美實驗儀器廠）。1.3 實驗方法3.1CM-SepharoseFastFlow離子交換層析一步法分離蛇毒原毒將蛇毒原毒凍干粉用Tris-HCl（pH8.6）緩沖液配成30mg/ml,4C過夜，20000r4C低溫離心30min,取上清，去除不溶物。將樣品上樣到Tris-HCl緩沖液平衡后的CM-SepharoseFF柱（甲5.5cmX50cm）,上樣量為900mg/30ml,蛇毒原毒上樣完成后先以Tris-HCl緩沖

11、液平衡，以除去未與陽高子結合的酸性和中性蛇毒蛋白。然后以00.4mol/LNaCl的Tris-HCl洗脫液進行梯度洗脫，流速為1.4,1.63.8ml/min,部分自動收集器收集洗脫液.每管10ml。核酸蛋白檢測儀測定洗脫液波長280nm處的OD值，以洗脫液在280nm波長處的吸收值（A280nln）為縱坐標，洗脫時間為橫坐標繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線，收集合并各洗脫峰。1.3.2SephadexG-25脫鹽將各分離樣品通過SephadexG-25脫鹽，洗脫液為三蒸水，洗脫流速分別為1.5.10ml/min0部分自動收集器收集脫鹽峰.每管6ml。核酸蛋白檢測儀測定洗脫液波長280nm處的OD值

12、，以洗脫液在280nm波長處的吸收值（A280nln）為縱坐標，洗脫時間為橫坐標繪制洗脫曲線。根據洗脫曲線.收集合并各洗脫峰。電導率儀檢測各管蛋白的電導率，以各管的電導率值為縱坐標，洗脫時間為橫坐標繪制電導率峰。將電導率值500的樣品收集合并后冷凍干燥，凍干蛇毒樣品于一20C密封保存。1.3.3反向高效液相RP-HPLC分析檢測各洗脫樣品及其純度各蛇毒純化樣品RPHPLC分析采用C18色譜柱（Shim-packPREP-ODS,4.6mmX250mm）。流動相A：0.1%三氟乙酸溶液；流動相B：0.1%三氟乙酸于70%的乙臘中。色譜條件：流速0.5ml/min,上樣后經60min流動相B從0%

13、到100%濃度梯度變化洗脫。檢測波長：280nm.樣品處理：20000r4C低溫離心15min,去除不溶物，以0.22ptm微孔濾膜過濾。樣品進樣濃度為0.5mg/ml,每次進樣最為20事，每樣品連續檢測6次。將純化組分SV5、組分SV6樣品按上述條件分別進樣洗脫。將CTX1標準品與組分SV6等體積混合，以CTX1作為內標進樣。通過比較各峰在HPLC中的保留時間確定組分與CTX1之間的關系，再根據各組分的峰面積積分計算蛇毒組分的蛋白純度。2結果13種流速對蛇毒原毒分離的影響舟山眼鏡蛇蛇原毒經CM-SepharoseFF陽離子交換凝膠柱層析可得到7個峰，分別為SV1SV7。總收集時間約32h,組

14、分SV5、組分SV6的含址較大，約占總上樣量:的1/3.改變洗脫流速對洗脫結果的影響較明顯，當流速為1.4.1.8ml/min時.各組分間無明顯差異，各組分間的峰谷未下降，含量較高的組分SV6與組分SV5之間分離效果較差；當流速為1.6ml/min時，組分SV4與組分SV5之間出現一個小峰，且各組分間的分離效果較好.含量高的組分SV5、組分SV6分離峰形比較完整，分離效果理想，見圖lo圖】CM-SepharoseFF陽離子交換蹇膠柱層析圖譜A：流速為1.4流速為1.6ml/min,C：流速為1.8ml/min.I.Tris-HCI平衡；II.00.4mol/LNaCITris-HCI梯度洗脫.

15、2.23種流速對純化樣品SephadexG-25脫鹽影ml/min時，鹽峰和樣品峰沒有分開，幾乎完全重疊,響SephadexG-25通過不同流速脫鹽，流速為1洗脫時間為158min,見圖2A；流速為5ml/min時,樣品峰后部分的電導率值500.脫鹽效果均不理想，洗脫時間為98min,見圖2B；當流速為10ml/min時，脫鹽效果理想，大部分峰的電導率值500,洗脫時間為44min.見圖2C.*a3Time(min)圖2SephadexG-25不同流速脫鹽圖A,流速為1ml/miniB：流速為5ml/miniC*速為10ml/min.2.3組分SV5和短分SV6的純度分析RP-HPLC分析圖譜

16、顯示，組分SV5、組分SV6均為單一成分。根據面積歸一化法計算純度，兩組分純度分別為95.8%、93.6%組分SV5的保留時間為43.5min,見圖3A；組分SV6的保留時間為44.8min,見圖3B0CTX1標準品的保留時間為44.8min,見圖樣，出峰時間完全吻合，見圖3D。3C.以CTX1為內標，與組分SV6等體積混合上圖3CTX1內標法RP-HPLC分析圖譜(上樣量20Ml,c=0.5mg/ml)A：組分SV5】3,組分SV6,C.CTX1標準品，D：CTX1驚準品與組分SV6等體枳混合.3討論蛇毒的成分十分復雜，其中75%85%為蛋白質。舟山眼鏡蛇SV中的蛋白質成分有100多種，其中

17、40%左右為細胞毒素(Cytotoxin),又稱為膜毒素(Membranetoxin)或心臟毒素(Cardiotoxin),具有廣泛的生物活性。舟山眼鏡蛇SV中主要有毒成分為神經毒、心臟毒、細胞毒，分子量均V10kDa,主要在67kDa之間。層析技術是一種操作比較簡便，設備不太復雜，樣品用最可大可小，既可用于實驗室的科學研究又可用于工業化生產的生化分離技術，是近年來國內外研究分離和純化蛇毒的主要方法但在實際應用中，柱形、凝膠的種類以及流速、梯度等的選擇，都直接影響到樣品的分離效果。當選擇一定的凝膠時，提高分離效果就要從改變流速或梯度等分離參數入手，從而找出最佳分離條件通過適當改變流速(降低梯度

18、斜率的一種手段)可以提高分離能力。本實驗所選用的凝膠為CM-SepharoscFF陽離子交換凝膠.通過改變流速，可得到不同的蛇毒樣品分離結果。SV經CM-SepharoseFF陽離子交換凝膠柱層析，按蛋白質的酸堿性強弱分離獲得SV1SV77個較顯著的蛋白峰,其中組分SV5和組分SV6的含量較大，為強堿性蛋白質，故在高離子濃度時被洗脫出層析柱。當流速為1.4J.8ml/min時，各組分間的分離效果不明顯.還有大部分交叉現象。當流速為1.6ml/min時分離效果比較理想。HPLC分析顯示，組分SV5、組分SV6均為單一成分。RP-HPLC根據疏水性的差異對蛋白質進行分離，其原理與疏水層析相似，但柱

19、效遠高于后者，是近年發展較快的蛋白質分離新技術。CTX與NTX、PLA的疏水性有較大差異(NTXCTXPLA),在C18柱上用乙月育梯度洗脫可將它們高效分離。此外,CTX含4對二硫鍵，性質十分穩定，在高濃度有機溶劑中不致失活，也是采用RPHPLC純化CTX的依據之一。RP-HPLC純化得到的CTX經凍干去除有機溶劑后，即可用于下一步的活性研究，也省去了其他分離方法的后續透析、濃縮等步驟。蛋白質脫鹽是蛋白分離純化一個必須的過程.脫鹽的效率與質量直接影響到分離純化的效果.如蛋白質的回收率、活性等。用膜包脫鹽是蛋白質脫鹽的常用方法，但是脫鹽的時間長、回收率低是其主要的缺點。SephadexG-25脫

20、鹽是利用分子篩原理將鹽分子和蛋白質分子分離的一種方法，大分子蛋白先于鹽分子被洗脫而將其分開。流速是影響SephadexG-25脫鹽的一個重要因素。通過本研究顯示，大流速有利于提高脫鹽效果，但是為了保護凝膠和穩定柱效流速不宜過大，以10ml/min為宜。KanedaN等利用反相高效液相色譜一步法從眼鏡蛇毒中分離CTX；OhkuraK等(以Sephadex-G75凝膠及CM-cellulose層析從泰國眼鏡蛇毒中分離獲得CTX；許云祿等【購采用SP-SephadexC-25陽離子交換法及SephasilPeptideC18反相高效液相色譜法從舟山眼鏡蛇毒中純化出細胞毒素;Wei-jianJiang

21、等通過SephadexG-50和CM-SepharoseFF兩步法分離蛇毒。本研究采用CM-SepharoseFF-步分離純化原毒，平衡緩沖液平衡時，能除去大部分酸性、中性未與陽離子結合的蛋白質，占總上樣量的50%左右。相比兩步法分離，一步分離能顯著縮短分離時間，增大上樣量，同時也避免了反復凍干對蛋白質活性造成的影響。因此，作者認為，利用CM-SepharoseFF陽離子交換凝膠柱層析一步法對舟山眼鏡蛇蛇毒純化進行分離時，分離最佳流速應為1.6ml/min。#文獻1 龔鑫，李懷斌，熊克仁.眼鏡蛇毒對大鼠樣IBc-fos表達的影響J.蛇志.2007,19(2):97-99.2 崔超偉，萱偉華.孔

22、天翰.眼鏡蛇毒細胞毒素CTXn的致死毒性及藥物依檢性研究J.蛇志.2010,22(2),85-88.3 楊嘉琳.孔天翰.急危重癥眼鏡蛇傷大鼠多項提血指標動態變化J.蛇志.2010,22(3):198-202.4 YangSH,ChienCM,LuMC.etal.Up-regulationofBaxandendonucleaseGtanddownmodulationofBcl2XLinvolvedincardiotoxin皿inducedapoptosisinK562cellsJ.Expmol.med,2006,38(4)：4352444.5 BragancaBM.PaterNT.Badrina

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24、manceliquidchromatographyJ.Chromatogr.1983.23(281):389-392.8 Wei-jianJiang.Ying-xiaLiang,Li-pingHan.etal.PurificationandcharacterizationofanovelantinociceptivetoxinfromCobravenom(Najanajaatra)J.Toxi-con,2008,52,638-646.9 Shinne-RenLin,Long-SenChang.Kee-Lung.Changs-eparationandstructure-functionstudiesofTaiwanCobracardiotoxinsJ.JournalofProteinChemistry,2002,21,2.10JE.V.Grishin,A.P.sukhikh.T.B.adamovichetal.T-heisolationandsequencedeterminationofacyotoxinfromthevenomforthemiddle-asiancobraJ.Febsletters,1974.42：2.11 袁明香.離子交換層析法M.北京：北京大學出版社，1994.36.