1、腸道病毒71型及其疫苗的研究進展楊俊杰'綜述；李薇'，王玉琳'審校(1蘭州生物制品研究所,蘭州730046;2北京微谷生物醫藥有限公司,北京100024)摘要:腸道病毒71型(E71,EV71)是手足口病的主要病原體,是一種具有較強傳染性和致病性的病毒，其流行范圍波及全世界,近年來在亞太地區尤其是在中國的流行日趨頻繁前HV71病原學病學以及動槌型的研究均取得了一定進展，為疫苗的研發奠定了相應的基礎，中國三家公司的EV71滅活疫苗現已率先獲得臨床批件,有望成為預防手足口病的有效手段。關鍵詞：腸道病毒71型；疫苗研究;動物模型；研究進展中圖分類號：R373-2文獻標識碼：A

2、文章編號:1005-5673(2011)02-005-06腸道病毒71型屬于小RNA病毒科(P)腸道病毒屬(E)，是引起手足口病(Hand-foodandmoudiHFMD)的主要病原體，并有一定的幾率引發無菌性腦膜炎(AszpacmeihgpH腦炎(Braiig】和脊髓灰質炎樣麻痹(P。偵y等多種神經系統并發癥1969年在美國首次分腐A來，EV71已在世界范圍內引起十多次爆發與流行，尤其是I997年以來,EV71在亞太地區的流行呈顯著上升趨勢"3來西亞3*坡亞等國以及中國的大陸V準和臺灣地區等均發生了不同程度的爆發流行，其中，臺灣1998年和2000年的EV71大爆發中分別有129

3、106人和80677人感染，并最終導致78人和41人死亡回1于缺乏有效的抗病毒藥物以及可用的疫苗,EV7【的廣泛流行造成了巨大的疾病負擔，同時也引起了社會的恐慌2008年中國安徽省阜陽市爆發人手足II病疫情，并隨后擴展到全國其他地區，全年共報告發病488955例，重癥病例1165例，死亡126例月衛生部把手足口病納入丙類法定傳染病管理009年，全年報告發病I15535例，死亡約例VH0年共報告病例1774669例，死亡905VHFMD在中國大規模流行己引起人們的廣泛關注文對EV71的病原學因分型，亍病學收稿日期:20lI-02-28;修回日期:20lI-03-10基金項目：甘謝科技重大專項(0

4、92GKDA010)通訊作者：王玉琳，E-m*ilyliw我i注r作者簡介:楊俊杰(I985-).男.碩士研尤生,主要從事病毒性疫苗的研究研發以及動物模型研究等作一綜述1病原學與基因分型1-1病原學特征EV71的病毒顆粒為直徑2430nm的二十面體立體對稱的球形結構，無包膜和突起V核心為一條長約7.4kb的正鏈RNA,基因組中僅有一個開放閱讀框，編碼含2194個氨基酸的多聚蛋白路聚蛋白可進一步被水解成PlVX三個前體街，PI前體蛋白編碼VP18。四種病爭卜殼蛋白，P2和P3前體蛋白編碼7個非結構蛋白(2A2C和3A3D)層的衣殼首先由四種衣殼蛋白構成原聚體，再由5個原聚體拼裝成具有五聚體樣結構

5、的亞單位,60個亞單位通過各自的結構域相互連接，形成病毒的衣殼和VP3三種結構蛋白裸露于病毒顆粒的表面，而VP4則位于病毒顆粒衣殼內側與RNA核心緊密連接而病毒的抗原決定簇基本上位于VP1VP3上其在VP1上含有多個中和抗原表位馬VP1蛋白的基因在外界選擇壓力下易發生變異從而賦予EV71病毒顆粒不同的抗原特性，因此VP1基因被認為是序列分析的最佳選擇*71受體研究顯示，VPI能與多種人類蛋白受體結合，在病毒對細胞的吸附以及穿入金過程中起著至關重要的作用C5oI-2EV7I的基因分型腸道病毒傳統的中和血清分型逐漸被基因分型所取代，至今腸道病毒己發現的10()多個血清型，按基因分型則分為腸道病毒A

6、D組，EV71和柯薩奇病毒A16(CoxMrkieirusAl6,CVAl6)均屬于腸道病毒A組71的基因分型主要基于VP1和VP基因基因編碼EV71的主要抗原決定簇具有高度的遺傳多樣性，它不僅可作為腸道病毒屬內不同血清型分類的依據，亦可作為小RNA病毒科內不同屬的分類參考，因此VPi基因被認為是系統進化分析最具研究價值的區域n等對113株EV71的VPlf亥酸序列的同源性進行了分析，首先將EV7I劃分為個基因型，屬于A型枚有BrCr原型株，與其他EV71分離株的核苜酸差異在I6.5o19.7%等m最近研究顯示2008年中國安徽省六安地區分離到的5株EV7I的VP1序列與BrCr株的同源性均超

7、過97.4%，屬于A型是繼1969年發現BrCr原型株之后，A型EV71株的首次被分離的報道因B型和C型又被進T劃分為BlB5以及ClC5亞型，也有學者將中國大陸地區流行的C4亞型進一步分為C4a和C4b群然EV7I結構蛋白VP4的氨基酸序列非保守，但其核昔酸序列的變異幅度達17.5%24-4%，也據此用于分子流行病學和基因分型的研究基因亞型之間和EV71與柯薩奇病毒之間艦的基因重組，使全序列的基因分型則更為準確'，但在流行病學調查方面有其局限性2流行病學2J血清流行病學迄今為止,EV7I流行已遍布全球，病毒主要通過糞-口傳播，且隱性感染者居多，因此易出現爆發流行是EV7I己知的唯一自

8、然宿主，EV7I酷對象主要為5歲以下的兒童，特別是1歲以下的嬰幼兒，產生神經系統癥狀的幾率較大*清流彳病學研究表明勇】，新生兒由于帶有母傳抗體，"具有EV71抗體，但一個月后會迅速下降;6個月至3歲的幼兒EV71抗體水平較低(4%26%);3-12歲的兒童因自然感染而EV71抗體陽性率從26%上升到5()%；成人血清EV71抗體陽性率在50%以上，證實了缺乏EV71保護性抗體是嬰幼兒高感染率和高死亡率的主要原因©德國的一項血清流行病學調查顯示，5，僅有27.3%的0-3歲幼兒以及45.6%的3-6歲兒童具有EV7I中和抗體，而63.4%的學前兒童無EV7I中和抗體，10歲以

9、上兒童和成人中和抗體陽性率均超過50%f.東南亞和南美地區血清流行病淌查也顯示了類似的數據表明了嬰幼兒血清中缺乏EV71中和抗體可能是引起EV7I大爆發并導致較高病死率的原因2J分子流行病學對腸道病毒衣殼蛋白VP1序列的分析己成為腸道病毒基因分型的金標準，也是分子流行病學研究的主要手段，通過EV71VP1基因序列的分析，發現EV71在流行過程中的基因型變化情況)9犢國首次分離并于1974年報道的EV71病毒株BrCrCAJO是一直以來僅有的A型株，2009年在中國安徽省六安地區又分離到5株A型株2(1止紀70-80年代EV71引起的爆發流行中，優勢毒株的基因型則為B型，包括1975和1978年

10、保加利亞和匈牙利分別導致44和47名兒童死亡的EV71第一次大爆發流行，以及美國僉大利亞國等的部流行8年之后，B基因型在美國消失，取而代之的是C基因型，而在美國以外的其他地區，尤其是東南亞各國，則出現了B和C基因型共流行和交替流行，包括198年期間中國的香港與臺灣僉國西等地的EV71第二次大流行，以及199800年發生丁東南亞各國的EV7I第三次大流行V*中B3四個亞型均于100年在馬來西亞流行中出現，B3一型為1997年流行的優勢基因型，但到2000年，則變為C1和B4亞型''幻，一時期中國的臺灣坡。|匚國大量病例報告顯示，患者以C2亞型感染為主，同時也有少量B4亞型的出現，

11、到2000年優勢流行基因型又轉為亞型年C基因型再次引起流行，但為以前從未出現過的©亞型"年則出現B5IE型，呈B型C型交替流行，而這種優勢基因型或亞型的替換與HFMD的爆發流行密切相關e1,對同一地區EV7I頻繁發生基因型的交替尚無確切解釋，2005年M預右等知一項長達6年的研究提示兩個可能的原因：EV71在鄰近國家或地區之間傳播活躍，導致不同基因型病毒株的頻繁引入或輸出；與所有RNA病毒相同,EV7I基因組突變頻率高，進化速度快，尤其是用來進行基因分型的VP1區，由于編碼病毒抗原表位面臨宿主免疫系統強大的選擇壓力，使其新發現的B5亞型在短期內便取代了C4亞型成為流行株，并

12、發生了抗原表位變異e中國自1981年上海發現的HFMD在全國十幾個省均有報道，從2007年至今，EV71的流行范圍和規模均進一步擴大，對分離到的EV71基因序列分析顯示，均屬于C4亞型，但不同時間不同地區分離到的C4亞型毒株也存有一定的差異，示0亞型在中國大陸較長時間的傳播過程中，可能通過變異和基因重組產生了不同的分支。EV71基因型間的交替與其基因重組現象是有一定聯系的，基因重組在腸道病毒中普遍存在，在同一次爆發流行中不同基因型病毒的共感染為病毒的基因重組提供了可能，如馬來西亞EV7I流行中同時出現四種基因亞型回W'HFVD的主要病脈為EV71和CVA16,以及存在其他的腸道病毒共同

13、感染，這都為EV71各基因型間的種內重組以及EV7I與其他腸道病毒（主要是CVA16瞥）的PI間重組提供了一定的條件'皿，增加了EV71流行的不可預測性，目前發現的基因重組主要發生在非結構蛋白基因區或非編碼區，一些重組株可能會發展成為某一階段的流行株，如造成2008年安徽阜陽HFMD大爆發的C4亞型為C4與CVA16的重組株2。©3疫苗研究EV71的持續爆發流行使得疫苗的研發變得非常迫切并備受關注，目前國內外很多研究機構正在致力于EV7I疫苗的研發*71疫苗的研究主要集中在滅活疫苗有舌疫苗j樣顆粒（ViuskepaoralVLP）疫苗一位疫苗V疫苗V嘩VP1中和表位的多肽疫苗

14、等研究方向些研究在實驗室階段均有一定的保護作用，但目前尚無上市疫苗用于EV71感染的預防得慶幸的是前不久國藥北京微谷生物醫藥有限公司京科興生物制品有限公司以及中國醫科院醫學生物學研究所率先完成rEV7I滅活疫苗的臨床前研究，獲得國家食品藥品監督管理局（SFDA）臨床研究批件，預計臨床試驗將很快啟動，有望成為預防手足曰病的有效手段Di-233滅活疫苗滅活脊髓灰質炎病毒疫苗（VV）對脊髓灰質炎感染和流行預防的成功經驗，亦可為EV71疫苗的研發借鑒過熱滅活的EV7I疫苗顯示出了良好勺免疫原性，用其免疫受孕前的母鼠，可在新生小鼠體內檢測到EV71中和抗體，該母傳抗體對以23OOLD知病毒株攻擊的保護效

15、果達80%以上，顯示出比VPI重組疫苗以及DNA疫苗更好的保護效果”門來西亞學者Ong等e用甲醛滅活一/鼠適應的EV71毒株MAV（B3亞型）制備的滅活疫苗，免疫小鼠后產生的抗體對B3C5«EV71均有良好的交叉中和活性，該滅活疫苗對ER乳鼠在I天一兩針免疫后，能抵抗5）LDMAV病毒株的攻擊一前尚不能證實其在小鼠源上以B3亞型外的其他基因型或亞型的EV71進行攻擊的交又保護性71滅活疫苗有效免疫劑量的研究顯示，80EU滅活疫苗可誘導靈長類動物產生高水平的中和抗體，并維持4個月以上臺灣一項研究探討了EV71滅活疫苗（C2亞型）與滅活脊髓灰質炎疫苗I咳疫苗流感嗜血搐疫苗V喉類毒素和破傷

16、風類毒素五價疫苗共同免疫的可行性結果顯示EV7I滅活疫苗與該五價疫苗的免疫效果互不干擾，EV71滅活疫苗單獨免疫和與五價疫苗共同免疫小鼠，兩針免疫后產生的中和抗體效價均為1:256,并對致死劑量EV7I活病毒攻擊具有保護性，同時所產生的抗血清對型的EV7I病毒具有廣泛的交叉中和作用，為今后EV71滅活疫苗與現有疫苗使用的可行性提供了一定依據制備滅活疫苗需要大量的病毒為基礎，目前報道用于EV7I滅活疫苗制備的細胞系主要是Veo細胞以及人二倍體細胞系KMB-I7,因此EV71在這些細胞系上的適應培養是研制EV71滅活疫苗的首要條件等'E實驗室選育的Veo細胞適薄株YN3-4a以及Dong等

17、D9選育的KMB-17細胞適應毒株FYW3KB在各自的適應細胞系上顯示出生長速度快滴度高等特性疫動物產的血清對不同時期O同地區分離的多株EV7I期"交叉保護作用，YN3-4a和FY-23K-B株是具有應用前景的滅活疫苗候選株卜，Wu等阮利用2L生物反應器進行了無血清Veo細胞微載體培養，為病毒的大量制備提供了條件，71通過生物反應微載體培養的病毒產量比轉瓶培養可提高三倍，在無血清培養條件下病毒滴度可高達58107TCP/n1且后續研究表明，與血清培養收獲的病毒相比，無血清培養的病毒免疫動物后產生的中和抗體滴度更高，此可見，無血清微載體培養的EV7I病毒為滅活疫苗的開發提供了有利的條件

18、目前國內外對EV71疫苗的研究主要為滅活疫苗，中國上述三家公司的EV71滅活疫苗獲得SFDA的臨床批件，表明在疫苗用毒種選育苗生產檢起藝研究以及疫苗評價動物模型等關鍵技木方面取得了突破，為生產人用EV71疫苗奠定了基礎。2基因工程疫苗基因工程疫苗的研究主要集中在EV71病毒樣顆粒疫苗以及通過各種表達系統表達的完整或部分VP1蛋白的亞單位疫苗©VLP由呈一定空間結構的結構蛋白組成，與全病毒相比，因其不含感染性的核酸，是理想的EV71疫苗®昆蟲細胞SF9共同表達P解【13CD蛋白，可組裝成VLP，其免疫效果優于經變性處理的VLP和熱滅活的EV7I病毒，能產生更高滴度的中和抗體,

19、對新生小鼠有更好的保護效果，并且VLP還能誘導產生細胞免疫應答，尤其產生較高水平的FN-2以及I：-4,于表達量和最后的收率械，限制了其大規模生產應用，最近，Chu331使用2L生物反應器對VLP的表達進行了進一步的研究，通過表達載體設計3細胞抱密度，模式恐氧量等關鍵參數的篩選，獲得較高的表達量（m廈），是用轉瓶培養產量的43倍rP釋放于細胞培養液，簡化了后續的純化工藝，提高了產品的收率，為規模化生產奠定了基礎外，其免疫小鼠產生的抗血清對EV71不同基因型具有的廣譜交叉保護作用，EV71VLP疫苗是一種很有前景的候選疫苗VP1±含有病毒主要的抗原決定簇，基于VP1蛋白的亞單位疫苗也是

20、基因工程疫苗的主要研究方向，有通過原核I蟲細胞表達系統以及轉地哺乳動物狎因植物成功表達EV7IVPI蛋郵J報道，并且都顯示出一定的免疫原性，Wu等對通過大腸桿菌BL2I原核表達的重組VPI蛋白疫苗（10田劑），免疫小鼠能產生對EV71四個亞型均有保護作用的中和抗體，誘導T輔助細胞增殖并產生高水平的I：-10和正N-些通過口服途徑謎的VPI疫苗如利用可食用植物因動物;汁C35以及在減毒的百日咳桿菌表面表達VP1蛋白正處于研究階段©3其他候選疫苗處于實驗室研究階段的候選疫苗還有減毒活疫苗V收疫苗和DNA疫苗等EV71減毒株S1-3CV是將脊髓灰質炎病毒S*bi!疫苗株位于5NTR合酶和3

21、NTR的溫螂感突變位點引入EV71BrCr株基因組構建而成的，盡管誘導產生的體液和細胞免疫應答很好，同時在小鼠感染模型以及貓猴感染模型上表現出神經毒力明顯減弱，但還是出現了輕度的神經系統癥狀，表明減毒并不徹底1#EV71的毒力決定位點研邢深入，在借鑒脊觥灰質炎口服活疫苗（OPV）成功經驗的基礎上,將有可能開發出減毒徹底的EV71減毒活疫苗多肽疫苗的研究主要集中在VPI上，目前對VP1蛋白的線性中和表位”以及T細胞表位3J研究己經比較清楚，但多肽的局限性在于其免疫原性較弱且表位較為單一，不能產生全面的免疫應答因此，設計出含有中和性B細胞表位以及T細胞表位的復合肽段對EV71感染的預防會更有意義T

22、uqg等"'將流行株中分離的EV71基因，經PCR擴增后克隆到真核表達質粒pVAXI構建了EV71DNA疫苗組質粒在Veo細胞中具有林VP南白的能力，但動物免疫效果不盡理想，隨著免疫佐劑峻系統等技術的發展，EV71DNA孀仍是很有發展前景的一種候選疫苗。4動物模型動物模型在病毒的毒力V苗效力的評價V性試驗等方面的研究具有重要的作用VX舟，EV71的動物模型主要有狒猴模型以及小鼠模型，密猴口J通過皮卜或脊髓接種的途徑感染EV71病毒并出現典型的神經系統癥狀，用于安全性評價和保護效果驗證，但由于價格昂貴，應用受限71感染的舊齡新生TR或BALB/t乳鼠是最為常見的EV71模型動物

23、一使用B3亞型的小鼠適應株，可通過灌胃與注射感染2周齡IR小鼠本研究成功了N0D/SCD小鼠感染模型4!,VP1GI45位k氨基酸點突變的變異株是N0DZCD小鼠的適應病毒株，病毒感染持續時間可達個月以上，組織分布也更廣泛，可用3周齡以上小鼠進行動物試驗，是該模型迄今為止能感染EV71病毒的年齡最大的小鼠中國大陸地區的EV7I流行株主要屬于C4亞型，而實驗動物普遍對該毒株不敏感®前主要建立了恒河猴感染模型以及IR乳鼠模型等3：通過腹腔注射對1日齡的TR乳鼠進行病毒感染，繪制了病毒在骨骼肌內的復制曲線,并聯合組織的病理變化，建立了中國流行的C4亞型毒株的小鼠模型河猴感染模型'0

24、在以EV7IIOCCD、,的劑量鼻腔感染（氣霧劑形式）后，可在中樞神經系統*系統H等檢出病毒，并伴隨利超病理組織學改變，為分析EV7I感染過程提供了病原學及病理學的指標5展望近十幾年來EV71在亞太地區越來越頻繁的爆發流行，現已成為一個嚴重威脅兒童健康的公共衛生問題71病毒被認為是脊髓灰質炎病毒即將消滅之際，最重要的嗜神經性腸道病毒，由于其致病機制以及流行趨勢目前尚不明確，既無可用的疫苗用于預防，又無有效的藥物用于治療，使疫情在很長時間內雅以得到緩解，而中國巳有三種候選疫苗獲準臨床fit件，給EV7I感染的成功預防帶來了希望。當前EV71研究己取得了一定進展，今后仍需進一步加強對EV71致病機

25、理，尤其是中樞神經系統致病機理的研究病毒受體研究的基礎上建立理想的動物模型，為抗病毒藥物的開發以及疫苗效果的評價提供條件強流行病學研究，建立完善的監測系統，及時了解病毒基因的變異情況，外，還應加強公共衛生條件的改善以及預防知識的宣傳，這將對預防和治療EV71感染具有重大意義考文獻：D1SdimidoNJ.?ntpptra>6|noEisihidironpwiaiCKwi1idixzucofA<2cxKralncriois;?5'>6taij.J再feu5Dis1974,129:304-309.DTomSolmon.PciinyLs&tideVk>電，岐.

26、paio-andoaniold'E71J.Laica6lii'<£6Dis2010,10:778-790.HunKY,LbiTY.E71infcaicni»xlprcrcn<M)nDJ-Tiii*inEpklanblbiiU6ii,200S.24：415-426.Qh6(:Z4uw.m(i.ai/pjbdiiKfcs/fiiotJ)y-Z0II02ZI>646.hanEB.51PWcXP,BouknJM.R<rcp6)rskltnoifkilferhaid.foaSaidmouAirusD.Nw.McxI.2009.15(7):7!8

27、-729.6 BrownBA,0bcr>6cMS.JrAbundciJP,willMokxkcpkle-miol1項dc£<>l(«nofE71>4iinsis>Bkd(r(wI970dol99SD-ViniI999,73:9969-9975.7 ShiniaH.Mofculi<pklur)cfE71r>4uWcstmPiicilvRcji)n)-PcdEiriasli<Krnax>niil2004.46:231-235.BYnHY.CJcdW.Gaitei:6eVPIrqy()n<)fE71refoiBu'

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29、t;>略，2010,39$:25-261.D11Ci4«iYF.PhIgjtfKctc<ifE71pcs;4nd«byuscxxpoiu5gc<mpl6c:qonicsxq:cbc。J-Iifet:-&nGcsKciirxundEiol(axi»2Of0.10:404-412.D2HoM.E71:Aeiris;i<S»iiica'iiiixaidatbrcakxD.MkrrobiollimsnoIJifcea2000.33:205-216.D3DilikiiS.Wtiibredi6A.Sdrcia!E.Secpra

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