1、調控調節性T細胞能有效防治原因不明復發性流產？1、項目研究意義復發性流產是一種常見的病理性妊娠，在育齡婦女中的發病率約為1%2%。其病因除與遺傳、解剖、內分泌、感染因素等有關外，仍有60%70%的患者病因不明，臨床上稱之為原因不明復發性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA）1,2。該病病因不明，療效不佳，常導致難治性不孕。由于多次妊娠和流產，給URSA患者身心帶來極大痛苦，嚴重影響了育齡婦女的生殖健康。因此，探索其病因，尋找合適、有效的治療方法，已成為目前生殖醫學領域亟待解決的問題。目前國內外的研究公認，URSA主要與母胎免疫耐

2、受機制紊亂有關3-5， 表現為CD4+/CD8+T細胞比值異常、Th1/Th2平衡失調、NK細胞亞群失調等。但是，調控這些免疫細胞的中心環節是什么？這仍是一個不解之謎。新近研究發現，調節性T細胞（regulatory T cell, Tr）是維持機體免疫耐受的主要因素。Tr是不同于Th1和Th2的具有調節功能的T細胞亞群，其中研究得較為清楚的亞型為CD4+CD25+Tr。CD4+CD25+Tr是由Sakaguchi等于1995年首次發現的，其特征為表達CD25（IL-2受體鏈）這一膜分子。CD4+CD25+T細胞在不同種屬呈進化保守性，對CD4+CD25-T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、NK

3、T細胞、樹突細胞等免疫細胞均具有調控作用6-8。它不僅在防止自身免疫耐受中起重要作用，而且還參與調控腫瘤免疫和移植耐受。目前生殖醫學領域對Tr的研究才剛剛起步，許多問題還懸而未決。探索Tr在母胎免疫耐受中的作用及其機制、Tr與URSA的關系，并探尋其用于治療URSA的可行性，對于URSA發病機制和防治措施的研究具有重要意義。本課題擬從臨床和實驗兩個層面，通過整體、離體、細胞及分子等水平，全面檢測URSA患者母胎界面和外周血CD4+CD25+Tr的表達和功能，研究該細胞調控母胎免疫耐受的具體機制，以及探索通過各種手段擴增或誘導該細胞的表達能否治療URSA。本課題的實施，不僅對豐富妊娠免疫耐受學說

4、有著重要的理論意義，并且對提高育齡婦女的生殖健康、努力構建社會主義和諧社會，也有著不可低估的現實意義。2、項目研究目標及與申請者研究工作長期目標的關系；研究目標1. 明確Tr在母胎免疫耐受中的作用特點。2. 明確Tr /Te平衡對妊娠取向的影響。3. 探討擴增、誘導CD4+CD25+Tr的條件。4. 探索通過調控Tr來防治URSA的可行性。與申請者研究工作長期目標的關系本課題組長期致力于免疫相關性妊娠疾病的研究，從血管舒縮因子到免疫調節，從整體器官細胞、分子水平逐步深入。尤其近年來，作為學科研究方向之一，對原因不明復發性流產（URSA）的病因、發病機制、治療進行了有意義的探討。本課題組最近的研

5、究發現：正常妊娠孕婦外周血CD4+CD25+Tr比率顯著增加，并且在妊娠過程中呈動態變化（詳見“工作基礎”）。本項目擬在此基礎上，通過探討CD4+CD25+Tr與URSA的關系以及在治療URSA中的作用，了解Tr在妊娠中的作用，豐富妊娠免疫耐受理論，并為免疫相關性病理妊娠的防治提供新的策略。因此，本項目研究是本課題組長期研究目標之一和重要組成部分。3、項目研究內容，研究方案和進度安排研究內容（一）臨床研究1. 分別檢測病例組（URSA患者）和對照組（正常妊娠人工流產者）外周血和蛻膜CD4+CD25+Tr的分布特點，以了解CD4+CD25+Tr數量與妊娠取向的相關性。2. 檢測上述被研究者外周血

6、和蛻膜中CD4+CD25+Tr抑制自身T細胞增殖的效率，以了解CD4+CD25+Tr功能與妊娠取向的相關性。3. 檢測上述被研究者母胎界面APC細胞中共刺激分子的表達水平，以了解CD4+ CD25+Tr與APC功能的相關性。4. 研究上述被研究者母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）細胞因子的表達水平，以了解CD4+CD25+Tr與Th1/ Th2平衡的相關性。（二）動物實驗1. 檢測不同劑量的TGF-、IL-10等細胞因子誘導CD4+CD25+Tr體外擴增的效果，以明確CD4+CD25+Tr大量擴增的最佳誘導方案。2. 檢測Foxp3基

7、因轉染后，CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉化的效率。3. 檢測過繼轉輸CD4+CD25+Tr后，自然流產模型小鼠胚胎吸收率的變化，以確定CD4+CD25+Tr對妊娠取向的影響。4. 檢測過繼轉輸后CD4+CD25+Tr在小鼠全身的定位，以確定其在妊娠過程中的分布特點。5. 檢測過繼轉輸CD4+CD25+Tr后，自然流產模型小鼠APC細胞中共刺激分子的表達水平變化，以了解CD4+ CD25+Tr對APC功能的影響。6. 研究過繼轉輸CD4+CD25+Tr后，自然流產模型小鼠母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2型（IL-4、IL-10、TGF-）細胞因子的表達水

8、平，以了解CD4+CD25+Tr對 Th1/ Th2平衡的影響。研究方法（一）臨床研究1. 實驗分組：實驗分為URSA組和正常妊娠人工流產組（正常妊娠要求人工流產病例）。免疫不耐受性流產的診斷標準為：流產病人排除夫妻雙方和胚胎染色體異常，子宮解剖結構異常，內分泌異常，生殖道感染，自身免疫性疾?。沽字贵w陽性、抗核抗體陽性）。2. 流式細胞術（FCM）檢測CD4+CD25+Tr的比率。3. 混合淋巴細胞反應（MLR）檢測CD4+CD25+Tr抑制淋巴細胞增殖的能力。4. 流式細胞術（FCM）檢測母胎界面APC細胞CD80、CD86等共刺激分子的表達。5. ELISA檢測母胎界面Th1型（IL-

9、2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）細胞因子表達水平。（二）動物實驗1. CD4+CD25+Tr體外大量擴增：不同劑量的TGF-、IL-10等細胞因子與CD4+CD25+Tr共同孵育。2. CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉化：構建Foxp3逆轉錄病毒載體，脂質體轉染包裝細胞PA317，篩選、擴增陽性克隆，轉染CD4+CD25-T。3. 實驗分組：實驗分為自然流產治療組（自然流產動物過繼轉輸CD4+CD25+Tr），自然流產對照組。4. 肉眼計數吸收胚胎數和存活胚胎數。按下式計算胚胎吸收率(R)：R = Re /Re + F。Re為吸收胚胎數，F

10、為存活胚胎數。5. 單光子發射計算機斷層掃描（SPECT）檢測CD4+CD25+Tr在受體體內的歸巢和分布。6. 流式細胞術（FCM）檢測母胎界面APC細胞CD80、CD86等共刺激分子的表達。7. ELISA檢測母胎界面Th1型（IL-2、IL-12、IFN-）、Th2 型（IL-4、IL-10、TGF-）細胞因子表達水平。技術路線（一）臨床研究URSA組和正常妊娠人工流產組分離外周血、蛻膜淋巴細胞CD4+CD25+Tr比率（FCM）CD4+CD25+Tr抑制能力（MLR）Th1、Th2型細胞因子表達水平（ELISA）分離胎盤、蛻膜組織分離胎盤、蛻膜APC細胞CD80、CD86表達水平（FC

11、M）（二）動物實驗誘導CD4+CD25-T向CD4+CD25+Tr轉化自然流產動物模型體外大量擴增CD4+CD25+Tr過繼轉輸CD4+CD25+Tr分離胎盤、蛻膜組織分離胎盤、蛻膜APC細胞CD4+CD25+Tr歸巢（SPECT）胚胎吸收率Th1、Th2型細胞因子表達水平（ELISA）CD80、CD86表達水平（FCM）進度安排2006.012006.03收集臨床標本；預定試劑、實驗室準備；進一步完善實驗設計。2006.042006.10檢測臨床標本中CD4+CD25+Tr的分布特點、功能變化，確定其與妊娠取向的關系和對共刺激分子、細胞因子表達水平的相關性。2006.112007.03分離、

12、純化、體外擴增CD4+CD25+Tr；建立動物模型，過繼轉輸CD4+CD25+Tr。2007.042007.10檢測動物模型中CD4+CD25+Tr相關分子的表達水平，確定CD4+CD25+Tr對妊娠取向及共刺激分子、細胞因子表達的影響。2007.112007.12結題、成果鑒定，申報新課題或獎項。4、項目創新之處現有的研究已發現，URSA主要與母胎免疫耐受機制紊亂有關，表現為：CD4+/CD8+T細胞比值異常、Th1/Th2平衡失調、NK細胞亞群失調等。但是，調控這些免疫細胞的中心環節是什么？這仍是一個不解之謎。最近在蒙特利爾召開的免疫學國際會議上，調節性T細胞在調控免疫應答方面的作用引起了

13、與會者極大興趣。所謂調節性T細胞(regulatory T cell, Tr)，是一類發揮免疫調節作用、維持自身免疫耐受的T細胞9。其主要通過細胞間接觸抑制分泌細胞因子IL-10、TGF-等方式下調針對外來或自身抗原的免疫應答以維持免疫耐受。目前認為，CD4+CD25+Tr在維持外周免疫耐受中起關鍵作用，全面監控免疫系統并維持免疫系統的穩定。臨床觀察證實：在早、中期妊娠母體外周血和蛻膜組織中，CD4+CD25+Tr比率明顯增加10；而自發性流產患者的蛻膜CD4+CD25+Tr比率則明顯降低11。動物實驗發現缺乏CD4+CD25+Tr可致小鼠妊娠失敗12。這強烈提示CD4+CD25+Tr介導母體

14、對胎兒的免疫耐受。但是關于CD4+CD25+Tr在母胎免疫耐受中的具體作用機制和作用環節，目前研究甚少。根據現有的免疫學知識，我們假設：胚胎抗原在激活母體效應性T細胞（Te）參與免疫應答反應的同時，還刺激母體Tr分化增殖，并通過細胞細胞接觸方式或分泌細胞因子抑制Te的功能，進而導致母胎免疫耐受；一旦Tr分化、發育障礙或功能減弱，或者Te生成過多，或逃逸Tr的監控則可出現流產等病理性妊娠。簡言之，調節性與效應性T細胞之平衡狀況是維持正常妊娠的關鍵。本課題將CD4+CD25+Tr引入妊娠免疫研究，從調節性T細胞這一全新的角度來研究妊娠免疫耐受的機制。并提出用“Tr/Te平衡”學說來詮釋母胎免疫耐受

15、之機制。本課題還以糾正Tr/Te失衡為切入點，嘗試通過調控Tr來糾正URSA，以探尋防治此種流產的新方法。從“Tr/Te平衡”角度來詮釋母胎免疫耐受理論，并以此為突破口來防治URSA，國內外尚無類似報道。該假說一旦被證實，將極大地豐富妊娠免疫耐受理論，并為此類流產、妊娠期高血壓疾病等一類免疫相關性病理妊娠的防治提供新的策略，從而保證了課題的先進性。5、工作基礎與工作條件1、工作基礎本教研室為浙江省、溫州醫學院兩級重點學科教研室。課題負責人黃引平師從同濟醫科大學婦產科內分泌專家吳熙瑞和馬庭元教授，自80年代末開始，致力于高危妊娠發病機制的研究。先后承擔或參加了多項國家自然科學基金課題、國家“七五

16、”、“八五”等科技攻關項目；1998年引入溫州醫學院后又相繼獲得兩項國家自然科學基金，具有豐富的科研經驗。本課題組前期的實驗已經證實：與非孕婦女比較，正常妊娠孕婦外周血淋巴細胞中CD4+CD25+Tr的比率顯著增高（見圖1）。比較早孕、中孕、晚孕婦女的外周血淋巴細胞，發現其中CD4+CD25+Tr的比率隨妊娠進展呈動態變化（見圖2）。本課題擬在此基礎上研究CD4+CD25+Tr與母胎免疫耐受的關系，并探索通過調控CD4+CD25+Tr來防治URSA的可行性。CD4CD25圖1 妊娠婦女與非孕婦女外周血CD4+CD25+Tr比率的比較妊娠婦女非孕婦女圖2 妊娠各期外周血淋巴細胞中CD4+CD25

17、+Tr的比率2、工作條件本學科實驗室已具備完成本實驗的基本設備，如細胞培養和分子生物學實驗相關儀器。所在醫院有專門從事基礎研究的醫科所，現已有設備配置超千萬元，基本滿足分子生物學、免疫學、細胞生物學、遺傳學等方面研究的需要；擁有的大型儀器有：倒置相差顯微鏡、CO2自動調節培養箱、超凈工作臺、立體手術顯微鏡、酶標儀、分光光度計、高速離心機、流式細胞儀、PCR儀、DNA合成儀、核酸測序儀、基因相差顯示系統、毛細管電泳、多種類型的電泳系統和成像系統等，能夠滿足本實驗需要。所在醫學院的實驗動物中心可提供清潔級以上的實驗動物及飼養條件。所需試劑材料均可從國內外公司購得。本實驗室與楊煥明教授領導的華大基因

18、公司和葉篤筠教授所在衛生部呼吸系統疾病重點實驗室有著很好的合作關系。因此，已具備完成本課題所需條件。6、預期研究結果及其利用研究結果的計劃和今后發展的思路本課題將為母胎免疫耐受理論提供新的學說，并為防治原因不明性流產等一類免疫相關性病理妊娠提供新思路。本課題的完成，有望使調控Tr成為防治母胎免疫耐受異常的有效手段，為攻克復發性流產和難治性不孕這些醫學難題提供新的途徑，給臨床上此類不孕患者帶來福音。研究成果預計可在國內外雜志上發表較高水平的學術論文46篇，并申報相關成果獎。本項目還將協助培養碩士生34名，博士生12名。7、參考文獻1. Whitcomb DJ. Abortion surveill

19、ance. AWHONN Lifeline, 2004, 8(2):112-114.2. 林其德。URSA的基礎與臨床研究進展。中華婦產科雜志，2003，38（8）：481-483。3. Aluvihare VR, Kallikourdis M, Betz AG. Tolerance, suppression and the fetal allograft. J Mol Med, 2005, 83(2):88-96.4. Carp H. Cytokines in recurrent miscarriage. Lupus, 2004, 13(9):630-634.5. Chaouat G, Le

20、dee-Bataille N, Dubanchet S, et al. Reproductive immunology 2003: reassessing the Th1/Th2 paradigm? Immunol Lett, 2004, 92(3):207-214.6. Fallarino F, Grohmann U, Hwang KW, et al. Modulation of tryptophan catabolism by regulatory T cells. Nat Immunol, 2003, 4(12):1206-1212.7. Trzonkowski P, Szmit E,

21、Mysliwska J, et al. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction. Clin Immunol, 2004, 112(3):258-267.8. Earle KE, Tang Q, Zhou X, et al. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T cell proliferation. Clin Immunol, 2005, 115(1