1、雄黃中砷對大鼠肝腎功能的影響 【摘要】 【目的】采用混合效應線性模型評價不同毒性劑量雄黃在大鼠體內的血砷濃度變化及對其肝腎功能的影響?！痉椒ā窟x用SD大鼠分別單次灌服3738、1869、0935g/kg雄黃，測定不同劑量組大鼠藥后各時間點/段血砷濃度及尿N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)、堿性磷酸酶(AKP)活性，血清天門冬氨酸氨基轉移酶(GOT)、丙氨酸氨基轉移酶(GPT)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)活力，并采用混合效應線性模型對其進行統計分析?！窘Y果】大鼠單次灌服不同劑量雄黃，尿AKP、NAG活力，血清BUN、GOT活力的改變有顯著的劑量依賴關系，并與血砷濃度變化有顯著的線性關系?！窘Y論

2、】在本研究劑量范圍內，雄黃中的砷可造成腎小管上皮細胞及肝臟的損傷，但未影響到腎臟的排泄能力。 【關鍵詞】 雄黃/毒性;砷/血液;肝腎功能;混合效應線性模型;大鼠雄黃(realgar)為硫化物類礦物雄黃族雄黃，具有燥濕、殺蟲、解毒之功效，既可單獨使用也可在復方中配伍使用。現代藥理研究顯示1，雄黃具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用，臨床上多用于治療急性早幼粒細胞白血病、慢性粒細胞白血病、帶狀皰疹、膿皰瘡、潰瘍性黑色素瘤、淋巴結核等疾病。雄黃是一種常見的含砷礦物藥，而砷(As)是一種常見的環境毒物和已知的人類致癌物。近年來動物實驗和人群流行病學調查均表明砷可引起不同程度的肝腎功能損傷3-4?，F就毒性劑量

3、下，雄黃在大鼠體內血砷濃度變化的毒代動力學及對大鼠肝腎功能的影響進行研究，以期為雄黃的合理、安全使用提供實驗依據?，F將研究結果報道如下。1材料與方法11儀器AFS920型雙道原子熒光光度計(中國北京吉天儀器公司產品)，As2型高性能砷空心陰極燈(中國北京有色金屬研究總院產品)，MK1型光纖壓力自控微波溶樣系統(中國海新科微波技術應用研究所產品)，Echo Lcd型全自動生化分析儀(意大利Lagotech儀器公司產品)，UV260型紫外可見光分光光度計(日本Shimadaz公司產品)。12主要試劑As標準溶液：1000g/mL，5%H2SO4介質，國家標準溶液GSB G 6202790，國家鋼鐵

4、材料測試中心配制;丙氨酸氨基轉移酶(GPT)試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司，批號：20070112;天門冬氨酸氨基轉移酶(GOT)試劑盒，上海科華東菱診斷用品有限公司，批號：20070122;肌酐(Cr)試劑盒，上?？迫A東菱診斷用品有限公司，批號：20070320;尿素氮(BUN)試劑盒，上海科華東菱診斷用品有限公司，批號：20061222;堿性磷酸酶(AKP)試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號：20070208; N乙酰D氨基葡萄糖苷酶(NAG)試劑盒，上海太陽生物技術有限公司，批號：67115。13受試動物SD大鼠，雌雄各半，體質量(30050)g，清潔級，由廣東省醫學實驗動物中心

5、提供，合格證號：0026252。14受試藥雄黃由廣州藥材公司購得，批號：20040612。經氫化物發生原子熒光法(HGAFS)測定其中As2S2的含量為9829g/kg，符合中華人民共和國藥典規定;經測定可溶性砷為(49900223)g/kg，其中可溶性砷中的三價砷為(24290195)g/kg。15給藥劑量和方法SD大鼠分為3組，分別一次性灌胃雄黃高劑量3738g/kg、中劑量1869g/kg、低劑量0935g/kg，灌胃量為10mL/kg。給藥前12h禁食，不禁水。16樣品采集161采血時間點及方法分別于藥前，藥后0、005、015、025、05、075、1、2、3、4、6、8、12、24

6、、32、48、56、72、80、96、168h眶后靜脈叢采血約10mL。張娟，等.雄黃中砷對大鼠肝腎功能的影響第4期2010年第27卷廣州中醫藥大學學報162分組每個劑量組32只大鼠隨機分為4組，每組8只，第1組在藥后005、075、4、24、72h采血，第2組在藥后015、1、6、32、80h采血，第3組在藥前、藥后0、025、2、48、96、168h采血，第4組在藥后05、3、8、12、56h采血。血樣經2400r/min離心10min分離血清，于-70冰箱保存待測。17檢測指標準確量取0406mL血清于聚四氟乙烯溶樣杯中，加入濃硝酸2mL，室溫下放置2h進行預反應，然后進行微波消化，05

7、、10mPa壓力下各加熱2min，冷卻后開啟消解罐。將聚四氟乙烯溶樣杯置于電熱板上加熱，趕盡NO2和過剩的HNO3，加水定容至10mL，稀釋一定倍數，測定樣品中血砷濃度。取第3組藥前、藥后0、025、96、168h血清，用于GOT、GPT、Cr、BUN測定;收集第1組大鼠096h各時間段尿液用于尿NAG、AKP的測定。18統計學方法采用SAS 913 統計分析軟件(SAS. . Institute Inc.， Cary， NC， USA.)進行混合效應線性模型的分析?；旌闲€性模型：Yijk=0j+1jArsenicij+b0i+ijk變量說明：Y代表待測指標(AKP、NAG、BUN、GOT

8、、Cr、GPT);i=1，2，3，分別代表雄黃高、中、低劑量組;j=1，2，3，分別代表待測指標不同測量點;k=1，8，代表第k次重復測量;Arsenicij代表第i個劑量組，在第j次測定待測指標時間點，平均血砷濃度去空白變化值;0j代表在第j次采血測量指標的時間段內，血砷濃度變化為零時，待測指標的去空白的測量值(即截距)，單位與待測指標的單位相同;1j代表在第j次采血測量指標的時間段，單位血砷濃度上升時，待測指標平均上升的值(即斜率)，單位為“待測指標/血砷濃度”;0j和1j共同表達固定效應，即血砷濃度變化對待測指標的影響;b0i代表不同劑量組的隨機效應，即不同劑量對待測指標與血砷濃度之間關

9、系的影響;ijk代表隨機誤差。2結果21大鼠單次灌服雄黃后各劑量組血砷濃度時間關系結果見圖1。大鼠單次灌服雄黃后，總砷在血清中吸收較快，分布、清除較緩慢，整個藥時過程中出現2個峰。高、中、低劑量組吸收半衰期t1/2(Ka)分別為146、0716、1542h;分布半衰期t1/2()分別為773、9437、8895h;消除半衰期(t1/2)分別為1721、24285、24234h;達峰時間tmax分別為3、6、1h。22血砷濃度對尿酶活性的影響結果見圖2和表1。為比較各時間段尿酶活力和血砷濃度的關系，故將各時間段內所測得各時間點血砷濃度進行平均，得到血砷的時間段數據。圖2-a、b中上面的3個圖從左

10、到右分別是低、中、高劑量雄黃組在10個時間段(time1)的AKP、NAG活力，下面的3個圖從左到右分別是低、中、高劑量雄黃組在10個時間段(time1)的血砷濃度去空白的變化值。其中time1=1、2、10分別代表02h、26h、612h、1224h、2432h、3248h、4856h、5672h、7280h、8096h。圖中折線是對圖中的數據點的平均值的連接。固定效應參數估計隨機效應參數估計時間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)02h1272819-01142低劑量組-3797526h2187564-004413612h3184853-0022161224h4247017-0

11、062332432h514502800662中劑量組0018013248h6157450006674856h7223596001535672h8256725-00466高劑量組377957280h919261702278096h1027544207704注：表示血砷濃度和AKP之間有顯著的線性關系(P=00134);表示3248h時間段斜率顯著比02h時間段高01809(P=00094);表示4856h時間段斜率顯著比02h時間段高01295(P=00103);表示7280h時間段斜率顯著比02h時間段高03412(P=00107);表示8096h時間段斜率顯著比02h時間段高08846(P0

12、0001)表1-a中固定效應參數估計說明，血砷濃度和AKP活力之間存在顯著的線性關系(P=00134)。從表中對應的參數估計可以看出，在實驗的前期，即224h各時間段的斜率比02h低，血砷濃度變化對AKP的影響基本是下降或接近水平。由此說明，在實驗前期， 隨著血砷濃度變化，AKP下降，隨時間推移下降幅度在變小;但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h時間段， 其斜率顯著高于02h時間段(均P002)，效應的參數估計分別是00667、00153、0227、 07704。即在實驗的后期，隨著血砷濃度變化，AKP上升，隨時間推移上升的幅度變大;通過隨機效應參數估計可以看出，雄黃給藥

13、劑量對AKP的影響是高劑量的AKP比群體平均劑量高出37795;中劑量基本與群體平均劑量類似，只高出001801;低劑量比群體平均劑量低37975。表1-bNAG活力和血砷濃度混合效應線性模型的參數估計固定效應參數估計隨機效應參數估計時間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)02h160789-00285低劑量組-0987326h235021-000779612h329539-0002251224h46080403-0019742432h579626-003027中劑量組031903248h6538970013354856h7621830018475672h8118877-00789

14、9高劑量組066837280h969767012128096h1010084406471注 ：表示血砷濃度變化和NAG活力之間有顯著的線性關系(P=00094);表示3248h時間段斜率顯著比02h時間段高004185(P=00113);表示4856h時間段斜率顯著比02h時間段高004697(P=00001);表示7280h時間段斜率顯著比02h時間段高01497(P00001);表示8096h時間段斜率顯著比02h時間段高06756(P00001);表示5672h時間段截距顯著比02h時間段高58088(P=00099);表示8096h時間段截距顯著比02h時間段高40055(P=0034

15、8) 表1-b中固定效應參數估計說明，血砷濃度變化和NAG活力之間存在顯著的線性關系(P=00094)。 從表中可以看出232h各時間段的斜率比02h時間段低，因此，在實驗的前期，血砷濃度變化對NAG的影響基本是下降的，即隨著血砷濃度變化，NAG下降。但是在后面的3248h、4856h、7280h和8096h時間段， 其斜率顯著高于02h時間段 (均P002)，對應的參數估計分別是001335、001847、01212、 06471。即在實驗的后期，隨著血砷濃度變化，NAG上升，隨時間推移上升的幅度變大;通過隨機效應參數估計可以看到，雄黃給藥劑量對NAG的影響是給藥高劑量的NAG比群體平均劑量

16、高06683;中劑量比群體平均劑量高出03190;低劑量比群體平均劑量低-09873。23血砷濃度對血生化指標的影響結果見圖3、表2和表3。為比較各時間段血生化指標和血砷濃度的關系，故將各時間段內所測得各時間點血砷濃度進行平均，得到血砷的時間段數據。圖3-a、b、c、d上面的3個圖從左到右分別是低、中、高劑量組在3個時間段(time2)的血BUN、GOT、Cr、GPT值;下面的3個圖從左到右分別是低、中、高劑量組在3個時間段(time2)的血砷濃度去空白的變化值。其中time2=1、2、3 分別代表 0025h、02596h、96168h。圖中的折線是對圖中數據點平均值的連接。表2BUN活力和

17、血砷濃度混合效應線性模型的參數估計變量參數估計標準誤差P 值固定效應截距-012360253406406血砷濃度變化: 斜率0007028000203800009低劑量組截距-032720437704570中劑量組截距034340451104489隨機效應高劑量組截距174220503800009注：表示血砷濃度與BUN有顯著線性關系，斜率估計0007028顯著大于零(P=00009);表示高劑量組的截距顯著比群體平均劑量的截距高17422(P=00009)由表2的固定效應可見，血砷濃度變化和BUN有顯著的線性關系(P=00009)。 隨著血砷濃度升高，BUN升高。因為通過運用似然比檢驗可知，

18、血砷濃度變化時間段的交互作用是不顯著的，說明在不同的時間段，血砷濃度變化和BUN之間呈現相同的顯著的線性關系;隨機效應說明劑量對BUN的影響表現為高劑量的BUN比群體平均劑量顯著升高，增高量是3個劑量組中最大的，為17422(P=00009);中劑量比群體平均劑量高03434;低劑量比群體平均劑量低03272。不同劑量對固定效應，即對“血砷濃度變化與BUN之間的相關關系”的影響不顯著。表3GOT活力和血砷濃度固定效應及隨機效應參數估計固定效應參數估計隨機效應參數估計時間段j截距(0j)斜率(1j)劑量組截距(b0i)0025h1685904-02120低劑量組-3976102596h22171

19、104-14316中劑量3671529-15821高劑量組-144063注：表示02596h時間段的截距顯著大于零(P=00382);表示0025h時間段的截距顯著比02596h時間段低-14852(P =00009);表示96168h時間段的截距顯著比02596h時間段低-14996(P=00006);表示02596h時間段的斜率顯著小于零(P00001);表示0025h時間段斜率顯著比02596h時間段高12196(P=00003)從表3中的固定效應參數估計可見， 在開始的0025h時間段，血砷濃度變化對GOT基本是接近的，對應的參數估計是-02120(P005)

20、;在中間的02596h時間段， 斜率顯著(P00001)，截距也顯著比0025h、96168h時間段高14852(P=00009)、14996(P=00006)，表中對應的斜率估計是-14316。在實驗的中期，GOT很高，隨著血砷濃度變化，GOT大幅下降，到后期截距回到671529，GOT回到實驗前期的水平。即在不同的時間段，血砷濃度變化和GOT之間呈現出不同的顯著的線性關系;表中的隨機效應參數估計說明了劑量對GOT的影響表現為高、中、低劑量比群體平均劑量分別低144063、高183825、低39761，但不同劑量對固定效應，即對“血砷濃度變化與GOT活力之間的相關關系”的影響不顯著。根據統計

21、分析，結果顯示Cr和GPT與血砷濃度變化之間無顯著相關性。3討論大鼠單次灌胃給藥雄黃的毒代動力學實驗中劑量的選擇是以前期急性毒性實驗所得半數致死量(LD50)為根據而設定的，分別設定1/2 LD50、1/4 LD50、1/8 LD50為毒代動力學實驗高、中、低劑量組，其中高、中、低劑量間呈比例關系，低劑量組是臨床等效劑量的10倍。尿酶活性在急性腎臟功能損害評價指標中最敏感， NAG和AKP主要反映腎小管上皮細胞的功能情況，而重金屬主要損害近段腎小管，因此考慮該2項指標可能對評價大鼠單次灌服毒性劑量雄黃的肝腎毒性更為敏感。BUN是從蛋白質的正常代謝中產生的廢物隨尿排出，因而其在血中的升高通常說明腎的損害。由于BUN含量受營養情況和肝臟毒性的影響，而后者可為許多藥物共有的作用結果，因此，在評價腎功能損害程度方面還要綜合血清肌酐檢查。Cr是肌酸代謝的產物，可完全經腎小球濾過，隨尿排出，血清肌酐常用來評價腎臟的排泄能力。肝臟血清酶學最常用的檢測指標是GPT和GOT。血清轉氨酶活性的高低與肝細胞受損的程度一致，GPT存在于肝細胞胞質水溶性部分，存在于細胞質水溶性部分及線粒體中。肝細胞損害嚴重時，不僅胞質中的酶釋放出來，而且線粒體中