1、褐藻酸裂解酶的結構、性質及應用Hee Sook Kim，Choul-Gyun Lee and Eun Yeol Lee摘要 褐藻膠是一種線性多糖，由-D-甘露糖醛酸（M）與其差向異構體-L-古洛糖醛酸（G）通過1，4糖苷鍵連接形成不同的結構。褐藻酸裂解酶因其高粘度及凝膠作用可作為一種食品添加劑來改善食品的質地。該酶可以通過-消除機制裂解糖苷鍵來降解褐藻膠，產生一個具有非還原末端的結構。褐藻寡糖已被發現具有促進人內皮細胞生長以及巨噬細胞細胞因子釋放的作用。褐藻膠可以通過褐藻酸裂解酶的內切及外切作用，降解為含有不飽和鍵的單糖。因此，在不久的將來，褐藻酸裂解酶有潛力作為生物催化劑，以褐藻膠作為可再生

2、資源生產生化試劑及生物燃料。本文介紹了不同的褐藻酸裂解酶的結構、功能并對褐藻酸裂解酶的應用前景進行了討論。關鍵詞 褐藻膠；褐藻酸裂解酶；褐藻寡糖；不飽和單糖1 介紹褐藻膠是一種線性多糖，其中其中-D-甘露糖醛酸（M）與其差向異構體-L-古洛糖醛酸(G)通過1.4糖苷鍵按照不同順序連接而成，其中-L-古洛糖醛酸是-D-甘露糖醛酸的C5異構體。這兩種糖醛酸可以形成聚甘露糖醛酸和聚古洛糖醛酸以及甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的隨機聚合物。褐藻膠在自然界存量豐富，其作為藻類植物的組成成分，占到了藻類植物干重的44%。一些細菌也可以合成褐藻膠。目前，褐藻膠主要用作食品添加劑來改變食物的質感，也被用作固定細胞及組

3、織的介質。商品級的褐藻膠可通過從海洋大型藻類中提取的方式生產。褐藻酸裂解酶通過-切割糖苷鍵來降解褐藻膠，生產多種以不飽和糖醛酸作為非還原末端的寡糖以及不飽和糖醛酸單體。多種褐藻酸裂解酶已從海藻、海洋無脊椎動物、海洋及部分土壤微生物中分離得到。褐藻酸裂解酶可以依據底物特異性分為PM特異性、PG特異性、PMG特異性。對于相應的底物特異性，褐藻酸裂解酶具有內切酶與外切酶兩種活性。褐藻寡糖已經顯現出許多引人注目的生物活性，它可以促進人內皮細胞的生長以及巨噬細胞細胞因子的釋放。因此，褐藻酸裂解酶作為制備功能性褐藻寡糖的生物催化劑引起了人們的注意。褐藻酸裂解酶自身也可作為藥物增強抗生素對銅綠假單胞菌的殺菌

4、功效來治療囊胞性纖維癥。不飽和的褐藻寡糖及不飽和糖醛酸單體可由褐藻酸裂解酶催化裂解得到。本文討論了褐藻酸裂解酶及其應用，特別是分析與對比了不同褐藻酸裂解酶的結構和功能，也討論了褐藻膠及褐藻酸裂解酶在未來的應用前景。圖1 褐藻膠的化學結構。褐藻膠是一種由-D-甘露糖醛酸與其C5異構體-L-古洛糖醛酸通過-1.4糖苷鍵按照不同順序連接形成的直鏈多糖。2 褐藻膠褐藻膠是一種帶有陰離子的多糖，由PM、PG、PMG組成，pKa 1.53.5。褐藻膠的生物功能主要是作為藻類的結構支撐物，其機械強度及彈性受到古洛糖醛酸單體含量的影響。隨著古洛糖醛酸單體含量的增加，膠體強度逐漸增大。較低的古洛糖醛酸單體含量會

5、使褐藻膠更有彈性。商品級的褐藻膠可從海藻中提取出來，廣泛用于食品工業和生物技術。褐藻膠可作為凝膠劑生產凝膠狀食品，增加冰淇淋的粘度，也可作為化妝品的增稠劑。褐藻膠也可用作減肥食品的配料，因為它不能被胃腸道消化，不能作為能量來源。褐藻膠可以結合二價陰離子，如鈣離子和鎂離子，產生凝膠作用。由于褐藻膠凝膠能力不受溫度影響并具有生物相容性，因而在許多生物技術的應用中，它被用于固定細胞。一般來說，高含量的古洛糖醛酸可以形成強膠體粘度。溶劑的pH對凝膠的形成影響顯著，因為不同的pH可改變糖醛酸上離子的排布。褐藻膠在醫學中應用廣泛。它可作為治療消化不良藥物的制劑輔料，可用于燒傷和創傷的敷料，因為它可以消除或

6、較小疼痛。褐藻膠也可用作牙科的矯形材料。褐藻膠還有許多其他方面的應用，例如作為螯合劑消除人體內的重金屬及放射性毒素。由于不與染料發生反應，它還可以作為增稠劑用于活性染料的染色過程。3 褐藻酸裂解酶3.1 褐藻酸裂解酶在褐藻膠的生物合成與生物降解中的功能多種褐藻酸裂解酶已從海洋交足類生物、褐藻、小球藻病毒、海洋及土壤微生物中發現并被克隆和表征。褐藻酸裂解酶在不合成褐藻膠與合成褐藻膠的生物中都被發現，在不合成褐藻膠的生物中，褐藻酸裂解酶在同化褐藻膠作為碳源的過程中起著重要作用。海洋及土壤微生物具有多于一種的褐藻酸裂解酶來降解結構復雜的褐藻膠。一些海洋動物在其消化道內也存在褐藻酸裂解酶來降解褐藻膠并

7、將其作為碳源。在能夠合成褐藻膠的微生物中，褐藻酸裂解酶在褐藻膠的生物合成與生物降解中都起著重要作用。對于產酶微生物的遺傳研究已經揭示了褐藻酸裂解酶的基因位于其他褐藻膠合成酶基因的片段上，在褐藻膠的生物合成中，褐藻酸裂解酶似乎對于控制聚合物長度與優化聚合反應起到一定作用。在合成褐藻膠的銅綠假單胞菌的粘膜上，褐藻酸裂解酶可以通過降解生物膜上的褐藻膠來促進細菌的擴散。固氮菌產生的褐藻酸裂解酶可能與其孢子萌發有關。在細胞休眠期，凝膠形式的褐藻膠是胞囊外被保護層的一部分，在萌發期，褐藻酸裂解酶對于胞囊的破壞是必要的。一些微生物可以使用褐藻膠作為碳源。此條件下，微生物可依靠褐藻酸裂解酶對-1.4糖苷鍵的裂

8、解作用降解褐藻膠，產生具有非還原末端結構的寡糖。褐藻膠聚合物通過內切酶的作用降解為具有非還原末端的糖醛酸，內切型褐藻酸裂解酶具有降解PM、PG、PMG的多種活性。褐藻寡糖可以通過外切型褐藻酸裂解酶的作用進一步降解為單糖。這些單糖可在無酶催化的條件下生產DEH，然后轉化為KDG，通過依賴NADPH的KDE轉化酶的作用，將KDG轉化為KDPG。之后，KDPG被KDPG醛縮酶分解為丙酮酸與3-磷酸甘油醛這一糖酵解途徑的重要中間體。一般來講，依靠褐藻膠生長的微生物使用胞外的褐藻酸裂解酶降解褐藻膠，然后將裂解產物轉運至細胞質中，并通過細胞代謝來吸收它們。例如鞘脂單胞菌等一些細菌可使用細胞周質中的ABC超

9、家族轉運系統直接吸收褐藻膠聚合物。負責吸收褐藻膠的外膜蛋白被證實在其表面有一個凹陷。整個轉運系統包括三個部分，在細胞表面一個直徑0.020.1m的凹陷，細胞質間隙的褐藻膠結合蛋白以及在細胞膜上的ABC超家族轉運系統。當褐藻膠被運轉至細胞質內之后，它被胞漿中的內切型與外切型褐藻膠裂解酶降解，在鞘脂單胞菌中，多種褐藻酸裂解酶存在于胞漿中。而對于棕色固氮菌，褐藻酸裂解酶存在于細胞周質表面。圖2 褐藻膠被內切型與外切型褐藻酸裂解酶通過-消除機制降解。不飽和單糖可由外切型褐藻酸裂解酶降解褐藻膠或褐藻寡糖的方式得到，這種單糖可在沒有酶催化的條件下轉化為4-脫氧-L-赤-5-己酮糖糖醛酸。箭頭所指為相應的褐

10、藻酸裂解酶的酶切位點。3.2褐藻酸裂解酶的結構褐藻酸裂解酶是多糖裂解酶系的一種，多糖裂解酶系可歸類為22個家族，依據對其初級結構疏水區域的分析，褐藻酸裂解酶屬于七個家族，PL-5、PL-6、PL-7、PL-14、PL-15、PL-17、PL-18。大多數細菌所產的褐藻酸裂解酶屬于PL-5與PL-7家族，兩種外切型褐藻酸裂解酶A1-IV （來源于鞘脂單胞菌） 以及Atu3025（來源于根瘤農桿菌）被歸類為PL-15家族。依據基因克隆及測序分析，PL-5與PL-7序列的相似性得到了對比。基因序列的對比揭示了PL-5與PL-7序列的相似性相對較低。然而，精氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、組氨酸、酪氨酸等對

11、催化作用的有重要影響的氨基酸在酶的活性中心大量存在。A1-、A1-、ALY-1、Atu3025的三維結構已通過X射線衍射晶體分析技術探明。來源于鞘脂單胞菌的A1-酶包含351個氨基酸殘基。該酶具有PG特異性。在研究該酶的三維結構時發現，其結構幾乎全部有-螺旋以及一個位于（-）6-管道部位的通道式縫隙組成。這種（-）6-管道結構的特征與在葡萄糖淀粉酶和纖維素酶中發現的結構類似。與A1-相比，PL-7家族的褐藻酸裂解酶含有大量的-串聯并在-折疊區有一個深的縫隙。這種折疊與-葡聚糖酶中的類似。來源于鞘脂單胞菌的A1-被進一步進行了突變分析，與ALY-1相似，A1-也有大量的夾層狀的-折疊，這些氫鍵網

12、絡與在活性中心的三個毗連的-折疊形成的結合部分已被證明對控制酶的活性具有重要作用。通過定點突變技術，發現在褐藻酸裂解酶A1-、A1-、ALY-1的催化位點上，酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺及谷氨酰胺、精氨酸的含量很高。據推測，這些氨基酸形成了酶的催化活性中心。最近，PL-15家族的外切型褐藻酸裂解酶Atu3025的結構已被查明。Atu3025可從分子外部降解褐藻膠、低聚糖形成不飽和單糖。Atu3025含有一個（-）6-管狀的結構中心，反向平行的-折疊層作為其基本支架。一個長度較短的-螺旋位于管道結構上。在中心結構域與C端結構域連接處的一個構象變化被證明對于外切降解作用非常重要。圖3 PL-5與PL-

13、7褐藻酸裂解酶的多序列對比。紅框表示位于活性位點的重要氨基酸，如精氨酸、天冬酰胺/谷氨酰胺、組氨酸和酪氨酸。圖4 來源于銅綠假單胞菌的褐藻酸裂解酶A1-III、A1-II的三維結構以及與三糖底物結合的活性位點。A1-III結構幾乎全部有-螺旋以及一個位于（-）6-管道部位的通道式縫隙組成。但是A1-II含有大量的-串聯并在夾層狀的-折疊區有一個深的縫隙。兩者的活性中心都含有酪氨酸、組氨酸、天冬酰胺及精氨酸。其蛋白結構已被Phyton Molecular Viewer顯示出來。3.3 褐藻酸裂解酶的性質褐藻酸裂解酶具有不同的底物特異性，其底物特異性被酶分子的氨基酸序列以及底物中單糖的排布所決定。

14、褐藻膠有四種不同的類型連接構成，分別是M-M、M-G、G-G、G-M，每種連接方式都可具有不同的長度。褐藻酸裂解酶可以根據他們的底物特異性分類。PG特異性的裂解酶優先降解PG結構，而PM特異性的裂解酶優先降解PM結構。一些褐藻酸裂解酶已被證實具有PMG特異性。迄今為止，大多數的褐藻酸裂解酶表現出PM特異性。雖然褐藻酸裂解酶可被歸類為PG裂解酶、PM裂解酶、PMG裂解酶，但他們通常對另一種糖醛酸聚合物表現出較低的活性。一些褐藻酸裂解酶表現出PM、PG雙重活性。從酶切方式上來看，褐藻酸裂解酶可分為內切型酶與外切型酶。多數褐藻酸裂解酶具有內切酶活性。最近，一些外切型褐藻酸裂解酶的例子已被報道并表征。

15、各類褐藻酸裂解酶的催化中心已被分析，一種可能的催化機理也已被提出。第一步，羧基上的負電荷被精氨酸與天冬酰胺所中和。接下來，C5上的質子經氨基酸殘基通過自由基催化機制分離出來。結果是氨基酸增加了二價羧基鹽陰離子的穩定性。最后一步，酪氨酸提供的一個質子在C4與C5之間形成雙鍵，糖苷鍵斷裂，形成具有非還原末端的寡糖鏈中的不飽和單糖。為使人理解并依據特定的寡糖來控制褐藻酸裂解酶的催化方式，更詳細的作用機制還需被說明。圖5 來源于根癌農桿菌的PL-15家族褐藻酸裂解酶H531A突變體的三維結構以及結合于三糖底物的活性位點。中心處的/-管狀結構以及反向平行的-薄層構成了Atu3025的骨架結構。圖6 內切

16、型與外切型褐藻酸裂解酶的活性位點。A1-III與ALY-1催化活性位點的關鍵氨基酸（A）。通過使用RasMol軟件，可看出A1-III的精氨酸239、天冬酰胺191、組氨酸192、酪氨酸246與結合在三糖底物上的ALY-1的精氨酸72、谷氨酰胺117、組氨酸119及酪氨酸195相互疊加。(B)Atu3025的催化活性位點。顯示了有催化作用的重要氨基酸圍繞著與三糖底物結合的不飽和非還原末端。通過CPK染色（碳原子和氧原子分別被染成灰色和紅色），底物分子可顯現出來。4 褐藻酸裂解酶的應用前景4.1 制備功能性褐藻寡糖包含37個單體直至2025個單體的褐藻膠降解產物通常被叫做褐藻寡糖。據報道，褐藻酸

17、裂解酶降解褐藻膠生成的褐藻寡糖具有多種生物活性。褐藻寡糖已在體內表現出益生素的特性。當被飼喂不飽和的褐藻寡糖之后，大鼠體內的雙歧桿菌與乳桿菌的比例從2.5增加到了5。由鏈霉菌產生的PG特異性褐藻酸裂解酶可促進香蕉海棠離體新梢、紅莧菜及其他植物的生長。褐藻寡糖具有多種生物活性，可用于醫療與生物技術。褐藻寡糖可以促進人巨噬細胞細胞因子釋放，可促進血管內皮細胞介導的人內皮細胞的生長及遷移。被注射了褐藻寡糖的小鼠，其粒細胞集落刺激因子數目增加，聚合度為39的寡糖可以增加巨噬細胞TNF-的表達量，其表達量為注射褐藻膠的10倍。聚合度為7和8的褐藻寡糖混合物表現出增加免疫細胞ROS表達量的效果。對褐藻寡糖

18、生物活性的研究已經發現其活性大小與其組成、分子大小以及寡糖鏈的結構有關。褐藻寡糖的作用機制還需要進一步闡釋。4.2 褐藻酸裂解酶的醫學應用細胞膜胞外多糖是一種對引起肺部感染的致病菌具有重要殺菌功效的因子。由銅綠假單胞菌合成的微生物褐藻膠，甘露糖醛酸殘基上C2或C3被-乙酰化。這種-乙酰化使得該類褐藻膠不易被褐藻酸裂解酶降解。因此銅綠假單胞菌可抵抗巨噬細胞的吞噬與抗生素的作用。在呼吸道中，褐藻酸裂解酶可增加抗生素的功效，因為褐藻酸裂解酶可消除銅綠假單胞菌胞外的褐藻膠。最近，褐藻酸裂解酶配合抗生素對囊胞性纖維癥的潛在作用已被研究。當褐藻酸裂解酶與慶大霉素等抗生素合用時，對于呼吸道中產黏蛋白的銅綠假單胞菌的殺菌效果有所增強。因此，如果褐藻酸裂解酶的抗原性被降低，它有可能成