1、用實時熒光定量PCR檢測石蠟標本中的麻風菌DNA以提高PB患者的確診水平溫溫 艷艷* *1 1 楊榮德楊榮德 2 2 譚福躍譚福躍2 2 邢邢 燕燕1 1 袁聯朝袁聯朝 1 1 李桓英李桓英1 1 1 1 首都醫科大學附屬北京友誼醫院首都醫科大學附屬北京友誼醫院 北京熱帶醫學研究所北京熱帶醫學研究所 100050100050 2 2 云南省文山州皮膚病防治所云南省文山州皮膚病防治所 6630006630001873，麻風病是由感染麻風桿菌造成的慢性傳染病,挪威 A. Hansen.從病人組織中發現麻風菌1943，氨苯砜類藥物用于麻風病的治療1958，WHO 成立了麻風防治機構,全球麻風病控制工

2、作統一計劃1981，WHO 推薦聯合化療方案.麻風病麻風病 麻風菌在人體感染的過程麻風菌在人體感染的過程卜亞臨床感染亞臨床感染無臨床癥狀無臨床癥狀自我痊愈自我痊愈過程MBPBLLLLBLBLB BB BBTBTTTTT 亞臨床階段亞臨床階段 中間發展過程中間發展過程 臨床變化臨床變化 分型分型 目前麻風已經不再是一種災難。1985年，122個國家中520萬人感染此病；1991年WHO提出：到2000年消除麻風作為一個公共衛生問題，指標為：1/10000，世界范圍總數少于6000000個病例；2005年，全球麻風病人降到3000000，目前，2000000病人，這主要歸功于1980年推廣的MDT

3、聯合化療。存在問題存在問題 全球麻風病每年病人數徘徊不變，在過去的8年，非洲、美洲和亞洲每年超過200000病人，提示：麻風病的傳播沒有阻斷，主要障礙是在哪里發生和如何傳播的信息不清楚；不能有效的早期診斷病人。Screening T Tests sS o u r c eNo. RegisterededEffective DateEnglishChineseMicroscopyDiagnos stic Criterion for L Leprosy 2008.01-16WS 291-2008WS 291-20082008-01-162008-01-16Slit Skin Smear &

4、& Acid-fast stainingMinistry of Public Health, Beijing, BeijingHisto-pathologySkin Biopsy in Leprosy, , D.S. Ridley, , CIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandCIBA-GEIGY, Ltd., Basle, SwitzerlandThird Edition,1990,19901990Leprosy ELISAIDRI, , Seattle, WA98104I-I-AS-0052010-12-0 06aWhole Blood (IFN-r

5、) AssayIDRI, Seattle, , W WA98104I-AS-0062006-0 01-0 05 bELISPOTT-SPOT.TB, Oxford Immunotec TH-TB-UK-V42008-04Nested-PCRThomas M.S., , J. Clin. Microbiol, 1990, 1990 Wen Yan, , Am. J. Trop. Med. Hyg., , 20132013 pp p. 1913-1917i in press2011-11-0 06Real Time PCRTruman RW, , PLoS Negl Trop Dis, 2008

6、2008 2(11):e3282(11):e3282012-10-22麻風病早期診斷的麻風病早期診斷的實驗室技術平臺實驗室技術平臺研究背景麻風病診斷：病理組織檢查和抗酸染色結合臨床檢查；病理學檢查包括病原學檢查抗酸菌（ AFB）、組織中病理變化；然而常規病理學檢查（HE）存在特異性、敏感性不足，特別是對查菌陰性、病理表現為非特異性改變的患者。 PCR技術用于皮損活檢和組織液的檢測，可檢出新鮮未固定組織標本中的微量麻風菌DNA，對早期和疑難病例的診斷有潛在優勢。研究背景本實驗室已經建立了Nested PCR和real time PCR方法：Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian

7、-Chao, Rong De Yang，Fu Yue Tan,Ying Zhang and Li Huan-Ying. Application of RLEP Real Time PCR for detection of M.leprae DNA in Paraffin-embedded Skip Biopsy Specimens for Diagnosis of Paucibacillary leprsy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 90(3), 2014, 524529Yan Wen, Xing Yan, Yuan Lian-Chao, Liu Jian, Ying

8、Zhang and Li Huan-Ying. Whole-Blood Nested-PCR Amplification of M. leprae-Specific DNA for Early Diagnosis of Leprosy. Am. J. Trop. Med. Hyg., 88(5), 2013, 918922 楊榮德，譚福躍，邢燕，劉健，溫艷，李桓英。實時熒光定量PCR檢測石蠟標本中麻風菌DNA 中國麻風皮膚病雜志 2013，29（7）目的將real time PCR方法應用于臨床初步診斷PB麻風病患者的石蠟標本；為形態學和臨床的麻風病診斷提供參考依據；檢測早期和疑似麻風病例，提

9、高對早期麻風的診斷水平。研究對象MDT治療前后的皮損組織石蠟包埋標本92例；BL型麻風患者石蠟標本2008年和2013年分別為7例和8例，共15例；2012年以來陸續收集70例臨床診斷PB麻風病患者的石蠟包埋組織標本。DNA提取 石蠟包埋組織標本的DNA提取。 切厚度為8-10m 的石蠟組織10片，放入1.5ml 離心管中,為了防止標本之間的交叉污染，在切不同的石蠟組織時，先用1摩爾的氫氧化鈉，再用75%酒精擦洗切片刀。提取DNA的過程嚴格按照DNeasy Blood & Tissue kit試劑盒（QIAGEN，Cat. NO.69504）操作手冊進行，脫蠟選用Deparaffini

10、zation Solution 試劑盒（QIAGEN， Cat. NO.19093）。建立real time PCR 使用Taqman探針通用PCR試劑盒(ABI, P/N 4304437)。 PCR循環條件為95變性15秒，60退火/延伸60秒，共40個循環，之前包括50 2分鐘和95變性10分鐘。 在ABI，Prismer 7500型熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）上進行實時觀測以及數據的采集與分析，擴增片段長度為101bp。 Real time PCR結果判定標準標準曲線及每個檢測標本均做復孔；初步確定取15Ct35作為陰陽性分析結果界定值。(每個反應管內的熒

11、光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數）結果 the RLEP real-time PCR 標準曲線Ten to 107 copies of the plasmid DNA were used for standard curve preparation Ct = -3.44log + 36.65; R2 = 0.9995. Amplification Curve: A: 107 copies /l plasmid; B: 106 copies /l plasmid; C: 105 copies /l plasmid; D: 104 copies /l plasmid; E: 103 copie

12、s /l plasmid; F: 102 copies /l plasmid; G: 10 copies /l plasmid.檢測結果-已確診的麻風病患者石蠟標本real time PCR檢測結果-臨床初步診斷PB和I型麻風病石蠟包埋組織標本討論 本研究對70例臨床初步診斷PB和未定類麻風病患者的石蠟標本采用real time PCR檢測，陽性率為 71.4%（50/70），病理檢測陽性率為 51.4%（36/70），兩者有顯著性差異，p 0.05。BT和TT患者中查菌陰性的和未定類患者real time PCR檢測陽性率均達66.7%，而病理檢測陽性率分別為60%、22.2%和44.4%，顯然對查菌陰性患者的輔助診斷價值較高；國外報告了60%-70%的顯微鏡檢AFB陰性的標本PCR結果陽性，本試驗得到了相似的結果；Real time PCR使用RLE